本发明专利技术公开了一种基因消除PCR的方法，本项发明专利技术可以消除混合基因群体中的非目标基因。本项发明专利技术的技术要点是把非目标基因做成或人工合成短序列基因消除引物，把含目标基因的混合基因群体酶切加上带有一个碱基误配的限制性酶切位点及带有Poly(dA)的接头，经过纯化作为模板，在PCR反应中，通过基因消除引物与模板退火延伸恢复正确的酶切位点，然后用耐热的限制性酶酶切从而消除非目标基因的接头，使其无法得到扩增。以上反应是利用PCR仪做如下循环：94℃，30秒；60℃，40秒；75℃，8分钟，经过12至18个循环，富集目标基因，然后常规PCR进一步扩增目标基因。本发明专利技术高效快速，操作简便，成本低廉，可重复性高，分离效果好且假阳性率低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属分子生物学领域，涉及一种基因消除PCR的方法，具体涉及一种通过PCR 的方法将基因群体中的非目标基因消除从而达到分离目标基因的目的，主要应用于生物学，医学，农学，畜牧兽医学，环境科学，食品科学等与分子生物学相关的基因消除和基因分离
技术介绍
PCR,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是 1985 年由美国 PE-Cetus公司的科学家Kary Banks Mulis专利技术的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的技术。这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的某些特点，实现在体外对某些特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内在试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术的原理是DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3’-0H末端，并以此为起始点，沿模板5’ -3’方向延伸，合成一条新的DNA互补链。PCR反应的基本成分包括模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。PCR 反应中，通过双链DNA的高温变性(denaturation)、引物与模板的低温退火(annealing)和适温延伸(extension)这三步反应反复循环。每一循环中所合成的新链，又都可作为下一循环中的模板。PCR合成的特定的DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，从而达到迅速大量扩增的目的。PCR技术操作简便、结果可靠，并被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发展产生了革命性的影响。然而我们使用PCR的目的是用来扩增已知或部分已知基因片段，对于那些我们未知的新基因，由于缺少相关信息，我们就无法有效地对其扩增。抑制性消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)是 Diatchenko等于1996年依据消减杂交和抑制PCR发展起来的一种分离差异表达基因的新方法。该方法主要基于抑制PCR,并结合标准化(normalization)和消减杂交 (subtractive hybridization)技术。所谓抑制PCR就是通过利用含引物序列的双链接头 (adaptor)充当引物模板，使两端接上同一接头的非目的双链片段(具有反向末端重复序列)，在退火时产生“锅-柄”结构，无法与引物配对，从而选择性抑制非目的序列的扩增，以达到抑制非目的片段而选择性扩增目的片段的目的。该方法运用了杂交二级动力学原理， 即高丰度单链cDNA在退火时同源杂交速度快于低丰度单链cDNA，标准化步骤平衡了目的基因群中cDNA的丰度，从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致，即低丰度差异表达的基因不会丢失，而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离。消减杂交5则扣除了目的基因群(tester)与驱赶基因群(driver)间的同源序列。SSH技术的操作流程首先提取2种细胞或组织的mRNA，并反转录获得cDNA，用含有4个碱基的限制性核酸内切酶(RsaI或HaeIII)酶切，产生大小适当的平端cDNA片段，将tester cDNA分为均等的 2份，各自连接接头，将过量的driver cDNA分别加到2份tester cDNA中，变性后退火杂交，获得4种杂交产物单链tester cDNA、双链tester cDNA、异源双链cDNA和双链driver cDNA。第一次杂交使单链tester cDNA均等化并富集差异表达基因，然后合并2份杂交产物，另加上新的变性单链drivercDNA，再次退火杂交；第二次杂交中只有第一次杂交后剩余的经均等化和消减的单链tester cDNA,它能与driver cDNA—起形成各种双链分子， 并产生新的双链分子，这种分子的2个5’端有2个不同的接头，使其能在以后的PCR中被有效扩增。2次杂交后，填平黏性末端，利用巢氏PCR原理进行扩增。作为一种快速有效的分离差异表达基因的技术，SSH技术具有高度富集低丰度 cDNA，操作简便，高效高速等优点。但同时它也存在假阳性高等不可避免的缺点在二次扣除杂交driver-cDNA过量，可掩盖tester-cDNA中表达有丰度差异的cDNA ;在SSH原理中认为二次杂交后，同时加上相同接头的片段链内退火优于链间退火，使得片段两端的反向重复序列形成类似“锅柄”的结构而无法扩增，然而在我们的实验中已经证实“锅柄”同样能高效扩增。另外一个例子就是RAPD (random amplified polymorphic DNA)技术,它的原理就是利用单弓I物对模板进行扩增。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种基因消除PCR的方法，利用基因消除引物，含有碱基误配的和Poly (dA)等特制的模板，耐高温的限制性内切酶及PCR组合等可消除混合基因群体中的非目标基因。本项专利技术的技术要点是把非目标基因做成基因消除引物，把含目标基因的混合基因群体酶切加上带有一个碱基误配的限制性酶切位点及带有Poly (dA)的接头，经过纯化作为模板，在PCR反应中，通过基因消除引物与模板退火延伸恢复正确的酶切位点，然后用耐热的限制性酶酶切从而消除非目标基因的接头，使其无法得到扩增。以上反应是利用PCR仪做如下循环94°C，30秒；60°C，40秒；75°C，8分钟，经过12至18个循环，富集目标基因，然后常规PCR进一步扩增目标基因。本项专利技术中的限制性引物即可以由非目标基因酶切扩增制备，也可以根据非目标基因的序列人工合成短核苷酸序列制备。特定的样品处理，特定的物种均可以工厂化大量制备相应的标准的基因消除引物供商业化使用。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施一种基因消除PCR的方法，其步骤是(I)基因消除PCR模板的制备a.限制性核酸内切酶ApeK-I和Mse-I消化含目标基因的混合基因群体；b.设计并合成四条寡核苷酸链01，02，03，04并制备接头，与上述⑴中a步骤的限制性酶切片段连接；c. Oligo-dT柱子纯化上述(I)中b步骤中加上接头的片段作基因消除PCR模板；(2)基因消除PCR引物的制备a.限制性核酸内切酶ApeK-I和Mse-I消化不含目标基因的混合基因群体；b.设计并合成四条寡核苷酸链05，06，07，08并制备接头，与上述⑵中a步骤限制性酶切片段连接；c.根据限制性内切酶位点与接头序列设计引物05和07对上述(2)中b步骤中加上接头的片段进行PCR扩增；d.采用乙醇沉淀法对(2)中c步骤中PCR产物进行纯化；e.限制性核酸内切酶Mse-I消化⑵中d步骤中纯化的PCR产物；f. PCR产物清洁试剂盒纯化上述⑵中e步骤中酶切产物作基因消除PCR引物；(3)基因消除PCR循环a.消除非目标基因，富集目标基因，条件为在94°C条件下预热I分钟30秒；12 至18个循环。每个循环包括94°C变性30秒，60°C退火40秒，75°C延伸8分钟。20ul反应体系为:40ng基因消除PCR模板，40ng基因消除PCR引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：桓娇娇，吕茹婧，张婷婷，程梦兰，董五辈，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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