用胚胎干细胞制备转基因禽类的方法技术

本发明专利技术涉及培养禽类胚胎干（ＥＳ）细胞的方法，该方法包含下列步骤：ａ）将起源于受精未孵育的禽卵胚盘的ＥＳ细胞用添加下列成分的基础培养基悬浮：胰岛素样生长因子１（ＩＧＦ－１）和纤毛神经营养因子（ＣＮＴＦ）；以及动物血清；和可选的至少一种选自白细胞介素６（ＩＬ－６）、白细胞介素６受体（ＩＬ－６Ｒ）、干细胞因子（ＳＣＦ）、成纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、白细胞介素１１（ＩＬ－１１）、制瘤素或心营养素的生长因子；ｂ）将步骤ａ）获得的ＥＳ细胞悬浮液接种于饲养细胞层上并继续培养ＥＳ细胞，使其至少传２至１０代；ｃ）可选地将至少一种选自ＳＣＦ、ＦＧＦ、ＩＬ－６、ＬＩＦ、制瘤素、心营养素或ＩＬ－１１的生长因子从培养基中去除；ｄ）用步骤ｃ）的培养基在饲养细胞层上继续培养ＥＳ细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及禽类生物技术并特别涉及制备转基因鸟类的方法。本 专利技术特别用于制备在卵中大量表达重组目的蛋白质的转基因鸟类。在过去的十五年中，治疗领域增长加速，已有超过400种生物分 子用于临床发展，市值超过300亿美元。绝大多数重组蛋白质需进行 特异性翻译后修饰以获得全部生物学活性并因此必须在大规模生物反 应器中在哺乳细胞内生长而制备。与此生产系统相关的成本以及需要 重要的定量是使整个生产过程的发展更加延迟的原因。在上下文中， 转基因动物可代表经济上有吸引力的替代物，尤其是如果修饰可通过 种系传递至子代时。家兔、山羊和牛引起人们极大的兴趣，长时间以来雌鸡被认为是 在鸡卵中制备重组治疗性蛋白质的最吸引人的快速、成本经济的生物 学制备系统。由于商业化雌鸡一年产卵约250枚，每枚卵含有近4克 卵白蛋白，所以鸡的产卵能力的确是非常强的。如果每枚卵仅可产100 mg重组蛋白质，那么一小群1000只雌鸡的鸡群每年可产25 kg粗制重 组蛋白质物质。此外，由于数十年来用鸡卵生产许多种人用疫苗，商 业性产卵工业已高度自动化且管理机构与鸡卵衍生产品相适应。同样，家禽工业也对使用转基因的方法加快商业目的的遗传性状 的选择产生兴趣(即meta克隆技术)。这个想法将绕过经典选择方 案[谱系—GGP—GP—PS]而以较短的时间得到目的鸡。家禽生产中 最可能用到的转基因技术可能是在转基因植物中是常见技术的增加抗 病性或改进食物的同化作用的技术。此外，转基因技术可能是保存禽 类遗传资源的策略。迄今为止，将谱系动物(家禽工业最有价值的动 物)分成不同地域是唯一的可在饲养场发生麻烦(例如病毒的传染) 时，防止多年的选择项目丧失的方法。这种方法是昂贵的且不能保证 可以抗衡国家卫生决定(强制对所有的本地家禽进行预防性消除以检 査病毒感染)(如2003年在荷兰进行的)。改良动物的工程化首次意味着可将转基因稳定导入动物的基因组中。25年来研究DNA导入的不同技术有(i)DNA微量注射技术，(ii) 病毒转导技术，(iii)精子介导的基因转移技术，(iv)核转移技术，(V) 基于细胞的使用原始生殖细胞的转移技术，或(vi)基于细胞的使用胚 胎干细胞的转移技术。已验证，在鸡中，仅有DNA微量注射技术(Love等人，1994 Biotechnology 12:60-63)和病毒转导技术(Bosselman等人， 1990 J. Reprod. Fertil. Suppl. 41 : 183-195)可有效地进行转基因的种系传递。然而，这两种技术都有一些限制这两种技术繁琐、艰苦并且 效率低，其部分原因是由于转基因的随机整合和沉默。病毒转导技术 还使插入到病毒载体上的转基因的大小受到限制。现在这两种技术不 能达到与商业发展相适应的蛋白质表达水平。将之前体外遗传工程化的原始生殖细胞(PGC)或胚胎干细胞(ES) 注射到发育中的鸡胚中的技术是禽类转基因技术中有前途的技术之 一，尤其是因为这些技术可使靶转基因整合入基因组内的可使转基因 高表达的特异位点。然而，为使用该方法制备转基因鸡，必须满足重要的先决条件体外操作时细胞必须存活，而同时保持其插入到受体 胚胎的能力，以定居于生殖细胞内并然后将修饰传递给子代。过去，为克服每个操作步骤的不同技术障碍进行了许多尝试，并 且今天通过将源自未孵化胚胎的新鲜分离的胚层细胞注射到新鲜产下 的胚胎的胚下腔内以获得体细胞的或生殖细胞的嵌合体。供体和受体 细胞的贡献在下列中评价(i)黑色素细胞群，通过检测黑和白色色素沉着(芦花斑纹鸡(Barred Rock)或褐色来亨鸡(Brown Leghorn)在 基因座I具有隐性等位基因而白色来亨鸡(Brown Leghorn)在基因座 I具有显性等位基因)；(ii)红细胞群，通过DNA指纹分析；(iii)性 腺，分析具有供体来源的表现型的子代(Petitte等人，1990 Development 108:185-189; Carsience等人，1993 Development 117:669-675; Thoraval 等人，1994Poultry Science 73:1897-1905; Pain等人，1996 Development 122:2339-2348)。胚层细胞注射48小时后(Etches等人，1996 Mol. Reprod. Dev. 45:291-288)直到培养7天(Pain等人，1996)可观察到 对体细胞组织和生殖细胞有贡献的嵌合体。Etches等人(1996)已证 明注射了与小鼠成纤维细胞共培养的细胞后可观察到显著的更多的体 细胞嵌合体。Pain等人(1996)将禽类胚层细胞接种在STO小鼠成纤维细胞上。培养中细胞的ES状态的保持依赖于ECMA-7和SSEA-1表 位的表达和端粒酶活性(Pain等人，1996)。白血病抑制因子(LIF) 和其他因子IL-ll、 SCF、 bFGF、 IGF-1的出现可刺激缺少分化的胚层 细胞的增殖，并且接触抗维甲酸的单克隆抗体可抑制其分化(Pain等 人，1996)。已表明当受体胚胎在注射入供体细胞之前进行放射线照射， 促进源自供体的细胞在胚胎中的定居(Carsience等人，1993)。然而，与注射新鲜制备的细胞后观察到的体细胞嵌合状态的频率 和程度相比，维持培养的胚层细胞产生的嵌合体较少，所述嵌合体对 体细胞组织表现出减少的贡献。然而，尽管如此证明可得到基于细胞 的禽类转基因策略的每个成分部分；用ES细胞技术获得的非转基因动 物未有描述。仍然需要制备转基因鸡的有效方法。这是本专利技术的目标。 为了达到这个目标并与本专利技术的目的相符合，如本文具体体现和广泛描述的那样，本专利技术提供培养禽类胚胎干细胞(ES)的方法，该方法包含以下步骤a) 使源自受精的优选未孵育的禽卵的胚层盘的ES细胞在添加下 列成分的基础培养基中悬浮-胰岛素样生长因子l (IGF-1)和/或纤毛神经营养因子(CNTF);和-可选地，至少一种生长因子，选自白细胞介素6 (IL-6)、白细胞 介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、 白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素ll (IL-ll)、制瘤素或心营养素； 和-动物血清；b) 将步骤a)获得的ES细胞的悬浮液接种到词养细胞层并继续培 养该ES至细胞至少传2至10代，优选2至20代；c) 可选地，将至少一种选自SCF、 FGF、 IL-6、 IL-6R、 LIF、制 瘤素、心营养素或IL-ll的生长因子从培养基中去除；d) 将ES细胞在饲养细胞层上在步骤c)的培养基中继续培养。 在优选的具体实施方式中，本专利技术的培养禽类胚胎干(ES)细胞的方法包含下列歩骤a) 使源自受精的优选未孵育的禽卵的胚层盘的ES细胞在添加下 列成分的基础培养基中悬浮-胰岛素样生长因子1 (IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)、白 细胞介素6 (IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、 成纤维细胞生长因子(FGF)和动物血清；b) 将步骤a)获得的ES细胞的悬浮液接种到饲养细胞层并继续培 养该ES至细胞至少传2至10代，优选2至20代；c) 可选地，将至少一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养禽类胚胎干（ＥＳ）细胞的方法，该方法包含下列步骤：　ａ）将起源于受精未孵育的禽卵胚盘的ＥＳ细胞用添加下列成分的基础培养基悬浮：　－胰岛素样生长因子１（ＩＧＦ－１）和纤毛神经营养因子（ＣＮＴＦ）；和－动物血清；和　－ 可选的，至少一种选自白细胞介素６（ＩＬ－６）、白细胞介素６受体（ＩＬ－６Ｒ）、干细胞因子（ＳＣＦ）、成纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、白细胞介素１１（ＩＬ－１１）、制瘤素或心营养素的生长因子；　ｂ）将步骤ａ）获得 的ＥＳ细胞悬浮液接种于饲养细胞层上并继续培养ＥＳ细胞，使其至少传２至１０代；　ｃ）可选地将至少一种选自ＳＣＦ、ＦＧＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＬＩＦ、制瘤素、心营养素或ＩＬ－１１的生长因子从培养基中去除；　ｄ）用步骤ｃ）的培养基在 饲养细胞层上继续培养ＥＳ细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2006-8-9 60/836,3781、一种培养禽类胚胎干(ES)细胞的方法，该方法包含下列步骤a)将起源于受精未孵育的禽卵胚盘的ES细胞用添加下列成分的基础培养基悬浮-胰岛素样生长因子1(IGF-1)和纤毛神经营养因子(CNTF)；和-动物血清；和-可选的，至少一种选自白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素11(IL-11)、制瘤素或心营养素的生长因子；b)将步骤a)获得的ES细胞悬浮液接种于饲养细胞层上并继续培养ES细胞，使其至少传2至10代；c)可选地将至少一种选自SCF、FGF、IL-6、IL-6R、LIF、制瘤素、心营养素或IL-11的生长因子从培养基中去除；d)用步骤c)的培养基在饲养细胞层上继续培养ES细胞。2、 根据权利要求1所述的培养禽类胚胎干(ES)细胞的方法，该 方法包含下列步骤a) 将起源于受精未孵育的禽卵胚盘的ES细胞用添加胰岛素样生 长因子1 (IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6 (IL-6)、 白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因 子(FGF)和动物血清的基础培养基悬浮；b) 将步骤a)获得的ES细胞悬浮液接种于饲养细胞层上并继续培 养ES细胞，使其至少传2至10代；c) 可选地将至少一种选自SCF、 FGF、 IL-6或IL-6的生长因子从 培养基中去除；d) 用步骤c)的培养基在饲养细胞层上继续培养ES细胞。3、 根据权利要求1所述的培养禽类胚胎干(ES)细胞的方法，该 方法包含下列步骤a) 将起源于受精未孵育的禽卵胚盘的ES细胞用添加胰岛素样生 长因子1 (IGF-1)、纤毛神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6 (IL-6)、 白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因 子(FGF)和动物血清的基础培养基悬浮；b) 将步骤a)获得的ES细胞悬浮液接种于词养细胞层上并继续培 养ES细胞，使其至少传2至10代；c) 可选地将至少一种选自SCF或FGF的生长因子从培养基中去除；d) 用歩骤c)的培养基在饲养细胞层上继续培养ES细胞。4、 根据权利要求1所述的方法，其中禽类是鸡。5、 根据权利要求1所述的方法，其中禽类是鸭。6、 一种将禽类胚胎干细胞进行遗传修饰的方法，该方法包含下列 步骤a) 用载体转染根据权利要求1-5所述方法培养的ES细胞；b) 选择已转染的ES细胞；C)筛选和扩增选定的遗传修饰的ES克隆；d)在包含动物血清和至少包含胰岛素样生长因子1 (IGF-1)、纤 毛神经营养因子(CNTF)和可选地包含至少一种选自白细胞介素6 (IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细 胞生长因子(FGF)的生长因子的培养基中在饲养细胞层上培养所述遗 传修饰的ES细胞。7、 一种获得嵌合体雏鸟的方法，该方法包含下列步骤a) 将根据权利要求1-5所述的方法培养的ES细胞导入受体禽胚 胎的胚下腔中；并b) 孵育步骤a)获得的胚胎直至孵出雏鸟；c) 选择所述包含已在所述雏鸟体内定居的异源细胞的嵌合体雏鸟。8、 一种获得遗传修饰的嵌合体雏鸟的方法，该方法包含下列步骤:a) 将于权利要求6的步骤d)中获得的遗传修饰的ES细胞导入受 体禽胚胎的胚下腔中；并b) 孵育步骤a)获得的胚胎直至孵出雏鸟；c) 选择所述包含已在所述雏鸟体内定居的遗传修饰的异源细胞的嵌合体雏鸟。9、 根据权利要求7和8所述的方法，其中所述嵌合体雏鸟的选择 根据羽毛表现型的分析进行。10、 根据权利要求7至9所述的方法，该方法包含在导入ES细胞 之前确定受体胚胎性别的附加的步骤。11、 根据权利要求7和IO所述的方法，其中步骤a)的培养的ES 细胞己于体外培养了至少5天。12、 根据权利要求7至11所述的方法，其中受体胚胎来源于新鲜 产下的未孵育卵并包含约5,000至约70,000个细胞。13、 根据权利要求12所述的方法，其中所述受体胚胎处于包含于 Eyal-Giladi & Kochav分类的VI期和XII期之间的时期，优选处于约 Eyal-Giladi & Kochav分类的X期。14、 根据权利要求7至13所述的方法，其中将至少1000个ES细 胞，优选至少15,000个ES细胞导入受体禽胚的胚下腔内。15、 根据权利要求7至14所述的方法，其中将至少30,000个ES 细胞导入受体禽胚的胚下腔内。16、 根据权利要求7至15所述的方法，其中导入受体禽胚的胚下 腔内的ES细胞是雌性和雄性ES细胞的混合细胞群。17、 根据权利要求7至15所述的方法，其中将雌性ES细胞导入 雌性受体禽胚的胚下腔内。18、 根据权利要求7至15所述的方法，其中将雄性ES细胞导入 雄性受体禽胚的胚下腔内。19、 根据权利要求7至18所述的方法，该方法包含在将ES细胞 导入所述受体禽胚的胚下腔内之前，用X或Y射线照射受体胚胎的附 加的歩骤。20、 根据权利要求19所述的方法，其中鸡受体胚胎用X射线以3 至6戈之间的剂量照射，优选约4戈剂量照射。21、 根据权利要求7至20所述的方法，其中将约15,000个鸡ES 细胞导入之前用...

【专利技术属性】
技术研发人员：I瓦拉尔谢，L巴塔尔，M梅泰利，
申请(专利权)人：维涡里斯公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]