一种柑桔的转基因方法技术

本发明专利技术涉及一种柑桔的转基因方法。它包括试管砧木、外植体的准备，嫁接苗的制备，嫁接苗的创伤感染，拟转化芽的嫁接，拟转化植株的分子生物学鉴定，以获得转基因植株，转基因植株的嫁接，其特征在于：所述方法中嫁接苗的制备是选用第二、三代嫁接苗作为起始材料。本发明专利技术是一种能有效地解决柑桔可周年进行遗传转化操作的转基因方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。它主要应用于柑桔类果树的品种改良。
技术介绍
柑桔品种改良所应用的转基因方法很多，主要有外源DNA直接转化法和根癌农杆菌 介导的转化法。外源DNA直接转化法所使用的外植体为原生质体，而柑桔类果树中很多品种的原生 质体培养周期长且再生困难，成本也较高，所以目前很少有实验室采用这种方法。根癌农杆菌介导法所使用的外植体很多，有无菌实生苗的上胚轴切段、子叶切块、 成年树茎段以及田间成年树腋芽等。利用无菌实生苗的上胚轴切段、子叶切块为外植体 的遗传转化频率高，但获得的转基因植株要经过漫长的童期才能开花结实。而以成年树 茎段为外植体所获得的转基因植株可以避开童期，但其出芽率和转化率极低。李卫等在 《植物学报》上发表了《柑桔基因转化新方法的研究》(1997， 39(8) :782-784),他们是 以田间成年树腋芽为外植体，釆用附体腋芽转化一离体扩繁鉴定的方法转化柑桔，所获 得的转化率为5.26%。但是这种方法在共培养过程中，需要不时的往棉球上添加出芽培 养基保湿3天，而且获得转基因植株需要走试管内生根这一途径。但柑桔一年只抽梢三 四次，因而在田间进行直接转化易受季节限制，操作麻烦，而且柑桔类果树试管内生根 很困难，同时也带来质粒向环境释放的安全性问题。何永睿等在《热带作物学报》上发表了《根癌农杆菌介导的柑桔遗传转化技术研究》 (2004， 25 (1): 11-16)。该论文对柑桔成年树腋芽在不同BA、 IM质量浓度处理、不同 创伤部位和是否用石蜡带包裹创伤口这三个方面的诱芽和转化率进行了研究，建立了一个 通用、简单、快捷的柑桔遗传转化技术体系。但是在实际的操作过程中，用石蜡带包裹 创伤口的操作难度大，且操作时间长，因而对植株的伤害很大，但是如果不用石蜡带包裹创 伤口，同时在稀释液中加入高浓度的细胞分裂素(10mg/l)，则创伤口很容易失水并形成愈 伤组织，很难再分化形成芽；同时，该方法是以第一代嫁接苗作为转化的起始材料，而在嫁 接的过程中，需要木质化或半木质化的柑桔成年树枝条，因而取材容易受到季节限制，不可 能周年进行遗传转化的操作。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简便的可周年进行遗传转化操作的柑桔的转基因方法。本专利技术的目的是这样实现的 ，包括试管砧木、外植体的准 备，嫁接苗的制备，嫁接苗的创伤感染，拟转化芽的嫁接，拟转化植株的分子生物学鉴 定，以获得转基因植株，转基因植株的嫁接，其特征在于所述方法中嫁接苗的制备是 选用第二、三代嫁接苗作为起始材料。上述方法中选用第二、三代嫁接苗作为起始材料，是将第一代嫁接苗从接穗上水平 切下，进行第二次嫁接，获得第二代嫁接苗；或将第二代嫁接苗的顶芽再次进行嫁接， 获得第三代嫁接苗；以第二或第三代嫁接苗作为转化起始材料，接穗与砧木之间用石蜡 带包缠。这样接穗和砧木的伤口愈合很牢固，而且在进行感染操作时就不会出现脱落的 现象；同时经过多次嫁接，可以获得更多的转化起始材料，以实现周年进行转化操作的 目的。为了加快遗传转化的周期，试管砧木的准备过程中，种子剥种皮时要用消毒的脱脂 棉进行固定。上述试管砧木准备过程中的种子接种无菌条件下用解剖刀将果实划开，取出种子，将种子放在脱脂棉上，剥去种皮，接种在已消毒的装有MS固体培养基的试管中；在28士2 'C下暗培养，砧木长到7 — 10cm长以备用。为了获得更高的转化效率，本专利技术在嫁接苗的创伤感染过程中采用5mg/l细胞分裂 素，不进行包缠；将不定芽嫁接在试管砧木上，对拟转化植株的DNA，进行PCR和 Southernbloting分析，获得转基因植株；练苗一周，以试管砧木作为中间砧，嫁接在 田间砧木上，套袋保湿l-2周。上述创伤感染过程中，转化起始材料保留了两片叶，从上往下，第二片叶的腋芽要 进行完全创伤。对第二片叶的腋芽完全创伤后，第一片叶腋芽的创伤口上很容易萌发出 不定芽，第二片叶的腋芽的创伤口处也可以萌发出不定芽，这样就可以获得更多的拟转 化芽，有利于转化频率的提高。本专利技术的有益效果-1、 在试管砧木的准备上，种子剥种皮时用消毒的脱脂棉进行固定，种皮容易剥离， 种子的萌发速度快，可以加快遗传转化的周期；2、 选择第二、三代嫁接苗作为转化起始材料，接穗和砧木的伤口愈合很牢固，而且 两者用石蜡带包缠，在进行感染操作时就不会出现脱落的问题。如果采用第一代嫁接苗 作为转化起始材料，在第一代嫁接苗中接穗上萌发的腋芽与接穗的结合不是很牢固，如 果直接在第一代嫁接苗上进行创伤感染，大概有80%的腋芽会脱落。3、 在转化过程中，维持整个植株的健壮生长是获得高诱芽率的必要条件，叶柄基部4在感染的过程中多少会受到伤害，此时如果再用石蜡带包缠，很容易使叶片脱落，不利 于整个植株的生长；为了避免伤口上愈伤组织的形成，本专利技术采用降低农杆菌稀释液中 细胞分裂素的办法，采用5mg/1的细胞分裂素而不进行包缠。本专利技术之所以对保留了 2 片叶的第二、三代嫁接苗从上往下的第二片叶的腋芽进行完全创伤，是因为，如果不这 样，对于切除了顶芽的第二、三代嫁接苗，第二片叶的腋芽萌发速度很快，长势也好， 营养优先供应，则伤口处不易萌发出不定芽。4、 本专利技术不直接对不定芽进行PCR鉴定，是因为从伤口处长出来的不定芽很容易被 质粒污染，同时因为用于提取DNA的叶片数量有限，没法进行Southernbloting分析， 导致假阳性率增高；试管内的不定芽很嫩，水份含量也高，如果将不定芽直接嫁接在田 间砧木上，则嫁接后很容易失水萎焉，导致嫁接成活率降低。本专利技术采用将不定芽嫁接 在试管砧木上，随着植株的逐步长大，叶片也逐步增多(如果用于提取DNA的叶片不够 的话，可以取拟转化植株的顶芽再进行一次试管内嫁接)，这样就可以对拟转化植株进行 Southernbloting分析，对检测为转基因植株的，练苗一周，以试管砧木作为中间砧，嫁 接在田间砧木上，套袋保湿l-2周，这样的嫁接成活率可高达95%以上。5、 经验证，运用本专利技术所述的柑桔转基因方法转化频率可以达到10%左右。彭爱红 等发表在《分子植物育种》(2009， 7 (1): 51-55)上的论文《根癌农杆菌介导甲型肝炎 病毒(HAV)衣壳蛋白融合基因转化柑桔成年材料的研究》中虽也提到10%的遗传转化率， 但那只是实验室的统计结果，在由实验室转向田间的过程中，有相当的一部分转基因植 株要死亡(如表l)。表l:实验室的遗传转化率与田间的遗传转化率的差异实验室的转基因 植株(株)实验室的 转化频率田间的转基因 植株(株)田间的转化频率论文方法2510%104%本专利技术方法2510%249. 6%总之，运用本专利技术所述的柑桔转基因方法田间的转化频率可以达到10%左右，同时本专利技术在获得转基因植株之前都是在室内进行的，因而可以有效地避免质粒向环境释放的可能且可以有效地避开柑桔的童期，嫁接到田间后2 — 3年就能开花结实。 具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不仅限于此。实施例1、试管砧木的准备。果实的准备选取柑桔成熟的、完好的果实用自来水洗净表面，在超净工作台上用 酒精表面消毒；无菌脱脂棉的准备用剪刀剪取一块长宽各10cm左右的脱脂棉，浸泡在75%的酒精中大约10分钟，拧干，以备用；种子接种无菌条件下用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柑桔的转基因方法，包括试管砧木、外植体的准备，嫁接苗的制备，嫁接苗的创伤感染，拟转化芽的嫁接，拟转化植株的分子生物学鉴定，以获得转基因植株，转基因植株的嫁接，其特征在于：所述方法中嫁接苗的制备是选用第二、三代嫁接苗作为起始材料。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈善春，何永睿，彭爱红，许兰珍，邹修平，彭祝春，
申请(专利权)人：中国农业科学院柑桔研究所，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]