【技术实现步骤摘要】
本申请属于动物实验，具体涉及一种动物实验中脑组织单细胞分离制备方法。
技术介绍
1、动物实验中，从动物组织中分离制备单细胞是一种基本的实验技术操作，一份高质量的单细胞悬液对于开展后续细胞培养以及相关实验数据的准确性和可重复性都具有出至关重要的作用。
2、现有技术中，常用的从动物组织中制备获得单细胞悬液方法有：研磨法、酶消化法等。但实际操作中，多根据组织类型、样品情况进行具体选择。
3、就高等动物脑组织而言，其结构上主要是指包容在颅腔内的三大块神经纤维组织：大脑、脑干和小脑。其中大脑又可分左右两个半球结构（两半球间有横行的神经纤维相联系），是脑组织的主要构成部分。大脑半球表层为皮质，皮质的深部由髓质或白质构成，髓质中又含神经纤维和基底核（灰质团块）；其中皮质占整个大脑半球的比例为40%左右，主要由神经元的胞体和神经胶质细胞构成。神经元通过相互之间形成的突触彼此连接，形成复杂的神经网络和通路，大量紧密交织的神经元突起和神经胶质细胞突起组成神经毡或神经纤维网，包围在神经元胞体周围。
4、由于脑组织较其组织相比其组成更为复杂，而且由于脑组织具有较强的粘连性，因此，常规的组织研磨法难以完全解离组织连接和获得足够数量的单细胞，同时组织研磨也不可避免地对极度灵敏的细胞活性造成较大的损失。因此，在制备获得脑组织单细胞悬液时主要采用的是酶消化法。即：先利用生物酶消化结缔组织和细胞外基质，同时通过减少脑组织块之间的粘连，从而更充分的从组织中获得目的细胞。
5、但实际实验操作及相关结果也表明，由于动物脑
技术实现思路
1、以小鼠脑组织为例，本申请目的在于提供一种操作较为简便和细胞活性较好的脑组织单细胞分离制备方法，从而为相关动物细胞实验的开展奠定良好的技术基础。
2、本申请所采取的技术方案详述如下。
3、一种动物实验中脑组织单细胞分离制备方法，该方法包括如下步骤：
4、（一）获得实验动物脑组织并进行预处理
5、以鼠为例，将实验动物处死后，立即对脑组织取样，并对所得脑组织样品使用hank's平衡盐溶液进行清洗以去除脑组织表面残留的血液等杂物；
6、清洗干净后，进一步去除脑组织外脑膜；
7、外脑膜去除干净后，将脑组织（包括：大脑、小脑）使用解剖刀切碎至肉糜状；
8、（二）酶解处理
9、将步骤（一）中切碎后实验动物脑组织置于酶解液中（1g脑组织加入10ml酶解液），充分混匀37℃酶解处理20~90min（酶解过程中，可吹打辅助组织解离）；
10、酶解处理结束后，将酶解后脑组织液过细胞滤网（规格：70μm），收集滤液；
11、所述酶解液，为添加有100~1000u/ml的 collagenase type 1、100~1000u/ml的collagenase type 2、2~4u/ml的dispaseⅱ、25~200u/ml的dnaseⅰ、300~700u/ml的papainpapaya的hank's平衡盐溶液；
12、优选配方为：添加有110u/ml的 collagenase type 1、110u/ml的 collagenasetype 2、2u/ml的dispaseⅱ、180u/ml的dnaseⅰ、360u/ml的papain papaya hank's平衡盐溶液；
13、（三）制备单细胞悬液
14、将步骤（二）所收集滤液，4℃、2000rpm/min离心5分钟，弃上清，将沉淀重悬后即为脑组织单细胞悬液；进一步可根据需要在重悬液中加入percoll工作液以进行不同类型细胞（例如单核细胞）的分离；
15、重悬沉淀时，采用培养基重悬；所述培养基具体例如为rpmi培养基。
16、分离获得单核细胞时，具体操作可参考为：
17、对加入有percoll工作液的脑组织细胞悬液，收集白膜层细胞，用0.04% pbsa进行清洗后离心，收集细胞沉淀，所得即为单核细胞。
18、本申请中，专利技术人以小鼠脑组织为例，通过对不同生物酶类型组合、生物酶用量比例的优化探索，获得了一种操作较为便捷、分离高效且细胞活性较好的脑组织单细胞分离制备方法，该方法具有如下技术优点：
19、1、对脑组织解离消化较为彻底，反应条件温和，对脑组织细胞损伤较低，细胞活率较高；
20、2、相较于专用的酶消化解离试剂盒成本更低，且酶解解离效果更优；
21、3、操作简便、酶解解离效果稳定，可操作性、效果可重复性较好。
22、总体上，采用本申请所提供的脑组织单细胞分离制备方法，可以获得数量更多、活性更好的单细胞分离群体，进而可为原代组织细胞培养、流式细胞术检测、单细胞测序等实验操作奠定良好的技术基础，因此，具有较好的技术实用价值。
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1.一种动物实验中脑组织单细胞分离制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
2.如权利要求1所述动物实验中脑组织单细胞分离制备方法，其特征在于，步骤（一）中，所述实验动物为鼠。
3.如权利要求1所述动物实验中脑组织单细胞分离制备方法，其特征在于，步骤（二）中，1g脑组织加入10ml酶解液。
4.如权利要求1所述动物实验中脑组织单细胞分离制备方法，其特征在于，步骤（三）中，所述离心为：4℃、2000rpm/min离心5分钟。
5.如权利要求1所述动物实验中脑组织单细胞分离制备方法，其特征在于，步骤（二）中，
6.利用权利要求1所述动物实验中脑组织单细胞分离制备方法的单核细胞制备方法，其特征在于，在脑组织单细胞悬液中加入percoll工作液后，收集白膜层细胞，清洗后离心，收集细胞沉淀，所得即为单核细胞。
【技术特征摘要】
1.一种动物实验中脑组织单细胞分离制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
2.如权利要求1所述动物实验中脑组织单细胞分离制备方法，其特征在于，步骤（一）中，所述实验动物为鼠。
3.如权利要求1所述动物实验中脑组织单细胞分离制备方法，其特征在于，步骤（二）中，1g脑组织加入10ml酶解液。
4.如权利要求1所述动物实验中脑组织单细胞分离制备方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏建设，徐煜翔，韩婷婷，孙琳，刘海璇，安照武，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：
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