The present invention relates to isolated adipose derived mesenchymal stem cells and methods of using the solution from the fat. On the one hand, the separation of adipose derived mesenchymal stem cells from fat method comprises the steps of: obtaining liposuction doped with fat like centrifugal expansion liquid; remove the upper oil, respectively, remove the suspended fat particles and fat particles are added to the bottom of the cell sedimentation; digestive enzyme mixture, oscillatory digestion, termination of digestion, centrifugation, resuspended cells with heavy precipitation; precipitation of suspended bottom cells, with red blood cell lysis and centrifugation, the cell suspension with precipitation; the cell suspension, filtration, separation as the primary adipose derived mesenchymal stem cells. It also involves the methods of isolating and culturing adipose tissue derived mesenchymal stem cells. The adipose tissue derived mesenchymal stem cells preparation is used to separate the digestive enzyme mixture from adipose tissue derived mesenchymal stem cells and the medium for culturing adipose mesenchymal stem cells. All aspects of the invention exhibit excellent technical effects as described in the instructions.
【技术实现步骤摘要】
从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法和使用的试液
本专利技术属于生物
,涉及一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法,特别是涉及一种自体脂肪间充质干细胞的分离培养方法。本专利技术还涉及上述自体脂肪间充质干细胞培养中所用的培养基及相关试液。使用本专利技术方法分离培养所述脂肪间充质干细胞时,能够呈现本专利技术所述优异技术效果。得到的这些自体脂肪间充质干细胞可以用于自体应用。
技术介绍
间充质干细胞(MCS)是成人干细胞具有多向分化潜能的热点细胞,是一种大多数成人器官中发现的具有骨形成能力和造血功能的细胞群体,可以从骨髓、脐血、脂肪中提取,在特定的培养条件下,间充质干细胞可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和肌细胞等。间充质干细胞是目前组织工程的主要种子细胞。经历了多年多学者的研究后,虽然组织工程已经获得了很大进展,然而,但由于目前缺乏理想筛选方法,间充质干细胞不易获取、体外扩增困难等限制,使其在临床级别回输的应用受到限制。因此,寻找一种易于获得、免疫原性低、易于体外扩增的临床治疗级别的种子细胞是目前组织工程迫切需要解决的问题之一。人们已经从脂肪组织分离出一类具有多向分化潜能的干细胞,并在体外培养特殊体系中成功地分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞与肌细胞等,这种可分化的干细胞被认可为脂肪来源的间充质细胞,即脂肪干细胞或脂肪间充质干细胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞,脂肪干细胞具有分化多胚层全能性特征,其中包括中胚层,内胚层和外胚层分化细胞的能力,能分泌许多潜在的有利的 ...
【技术保护点】
从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法,其包括如下步骤:(1)将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本于离心管中,500~1000rpm离心2~5min;(2)移除最上层油脂,并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀,备用;(31)向步骤(2)所得脂肪颗粒中以体积比1:0.8~1.2加入消化酶混合液,在37℃以100rpm振荡消化20~40min;消化结束后,加入等体积的完全培养基终止消化,1000~2000rpm离心3~8min,弃上清,PBS重悬细胞沉淀;(32)将步骤(2)所得底层细胞沉淀用PBS重悬,加入等量红细胞裂解液静置5~15min进行裂解;红细胞充分裂解后,1000~2000rpm离心3~8min,弃上清,PBS重悬细胞沉淀;(4)合并步骤(31)和(32)所得细胞悬液,100μm滤网过滤,分离出作为原代的脂肪间充质干细胞;任选的对该脂肪间充质干细胞进行进行相关检测。
【技术特征摘要】
1.从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法,其包括如下步骤:(1)将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本于离心管中,500~1000rpm离心2~5min;(2)移除最上层油脂,并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀,备用;(31)向步骤(2)所得脂肪颗粒中以体积比1:0.8~1.2加入消化酶混合液,在37℃以100rpm振荡消化20~40min;消化结束后,加入等体积的完全培养基终止消化,1000~2000rpm离心3~8min,弃上清,PBS重悬细胞沉淀;(32)将步骤(2)所得底层细胞沉淀用PBS重悬,加入等量红细胞裂解液静置5~15min进行裂解;红细胞充分裂解后,1000~2000rpm离心3~8min,弃上清,PBS重悬细胞沉淀;(4)合并步骤(31)和(32)所得细胞悬液,100μm滤网过滤,分离出作为原代的脂肪间充质干细胞;任选的对该脂肪间充质干细胞进行进行相关检测。2.根据权利要求1的方法,其特征在于:步骤(1)中,以800rpm离心3min;步骤(31)中,脂肪颗粒与混合酶以体积比1:1的比例加入;步骤(31)中,在37℃以100rpm振荡消化3min;步骤(31)中,终止消化后,以1500rpm离心5min;步骤(32)中,加入等量红细胞裂解液静置10min进行裂解;和/或步骤(32)中,红细胞充分裂解后,1500rpm离心5min。3.根据权利要求1的方法,其特征在于:所述膨胀液包含:0.1mg/ml利多卡因和0.02ug/ml肾上腺素;所述消化酶混合液中包含:0.05%胶原酶I型、0.05%胶原酶II型、0.03%中性蛋白酶、0.03%DNA酶和任选的异丙醇;所述脂肪是从人体任何部位获取的脂肪;步骤(4)中,所述相关检测是指检测细胞形态以及免疫表型鉴定;例如,所述免疫表型鉴定是指对CD73、CD90、CD105和CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34进行检测;和/或其所分离得到的脂肪间充质干细胞可用于进一步的培养繁殖或者用于临床治疗。4.分离和培养脂肪间充质干细胞的方法,其包括如下步骤:(1)将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本于离心管中,500~1000rpm离心2~5min;(2)移除最上层油脂,并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀,备用;(31)向步骤(2)所得脂肪颗粒中以体积比1:0.8~1.2加入消化酶混合液,在37℃以100rpm振荡消化20~40min;消化结束后,加入等体积的完全培养基终止消化,1000~2000rpm离心3~8min,弃上清,PBS重悬细胞沉淀;(32)将步骤(2)所得底层细胞沉淀用PBS重悬,加入等量红细胞裂解液静置5~15min进行裂解;红细胞充分裂解后,1000~2000rpm离心3~8min,弃上清,PBS重悬细胞沉淀;(4)合并步骤(31)和(32)所得细胞悬液,100μm滤网过滤,分离出作为原代的脂肪间充质干细胞;(5)将分离出的原代脂肪间充质干细胞按照30000细胞/cm^2接种至培养瓶进行培养,加入完全培养基,37℃5%CO2培养;(6)培养2天后换液,去除非贴壁细胞,待生长到一周时,收获P1代脂肪间充质干细胞;(7)取少量细胞照步骤(5)和步骤(6)继续传代至下一代直至P5代,收获并观察各代次脂肪间充质干细胞,并进行相关检测。5.根据权利要求4的方法,其特征在于:步骤(1)中,以800rpm离心3min;步骤(31)中,脂肪颗粒与混合酶以体积比1:1的比例加入;步骤(7)中,所述相关检测是指检测细胞形态以及免疫表型鉴定;例如,所述免疫表型鉴定是指对CD73、CD90、CD105和CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34进行检测;步骤(31)中,在37℃以100rpm振荡消化3min;步骤(31)中,终止消化后,以1500rpm离心5min;步骤(32)中,加入等量红细胞裂解液静置10min进行裂解;步骤(32)中,红细胞充分裂解后,1500rpm离心5min;其中还包括使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行制剂的制备步骤;和/或其中还包括使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行细胞冻存的步骤,任选的对所冻存的细胞进行复苏,以及任选的对复苏的细胞进行制剂的制备。6.根据权利要求4的方法,其特征在于:步骤(1)中,所述膨胀液包含:0.1mg/ml利多卡因和0.02ug/ml肾上腺素;所述消化酶混合液中包含:0.05%胶原酶I型、0.05%胶原酶II型、0.03%中性蛋白酶、0.03%DNA酶;所述完全培养基包含:低糖型DMEM、10%FBS、25mM的HEPES、1μg/ml的EGF、2μg/ml的bFGF、0.02μg/ml的TGF-β、0.05μg/ml的IGF;所述DMEM为低糖型DMEM;所述低糖型DMEM配方组成如下:无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL;和/或所述完全培养基组成为:100mL的FBS、25mM的HEPES、1μg/ml的EGF、2...
【专利技术属性】
技术研发人员:王芳,梅俊,
申请(专利权)人:英科博雅生命科技有限公司,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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