人脐带血间充质干细胞源分离外泌体的方法和使用的试剂技术

本发明专利技术涉及人脐带血间充质干细胞源分离外泌体的方法和使用的试剂。具体的，本发明专利技术方法包括：(1)、脐带血间充质干细胞的培养，和(2)、脐带血MSC外泌体的提取；其中，所述脐带血间充质干细胞的培养是使脐带血间充质干细胞培养至P3代；所述脐带血MSC外泌体的提取包括如下步骤：外泌体悬液预处理，以及外泌体提取。本发明专利技术使用的试剂涉及具有特殊配方的作为缓冲垫的溶液。本发明专利技术方法具有如说明书所述优异技术效果。

Method for separating exocrine from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells and reagent used

The invention relates to a method for separating exocrine from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells and a reagent used. In particular, the methods of the invention include: (1) culture of umbilical cord blood mesenchymal stem cells, and (2) extraction of MSC exudate from umbilical cord blood; among which, the culture of umbilical cord blood mesenchymal stem cells is to train umbilical cord blood mesenchymal stem cells to the P3 generation; the extraction of MSC exudate of umbilical cord blood includes the following steps: exocrine suspension Treatment, and extraction of exocrine. The reagent used in the invention relates to a solution with special formulation as cushion. The method of the invention has excellent technical effect as described in the instruction.

【技术实现步骤摘要】
人脐带血间充质干细胞源分离外泌体的方法和使用的试剂
本专利技术属于生物
，涉及一种获取参与细胞生物活动的膜泡的方法，尤其涉及一种由人脐带血间充质干细胞(MSC)分离并获取外泌体(Exosome，或记作Exosomes)的方法，以及其在细胞修复中的应用。特别地，本专利技术涉及人脐带血间充质干细胞源分离外泌体的方法，此外，本专利技术还涉及使用的试剂。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是来源于中胚层的一类非造血系统多能干细胞，现已证实MSCs除具有自我更新和多向分化潜能外，还具有很强的抗炎和抑制多种免疫细胞的能力，并能够诱导外周免疫耐受。研究表明MSCs通过分泌多种免疫调节因子，如IFN-γ、PGE2等(可参见：PolchertD,SobinskyJ,DouglasG,KiddM,MoadsiriA,ReinaE,etal.IFN-gammaactivationofmesenchymalstemcellsfortreatmentandpreventionofgraftversushostdisease.Europeanjournalofimmunology.2008；38(6):1745-55.以及SpaggiariGM,AbdelrazikH,BecchettiF,MorettaL.MSCsinhibitmonocyte-derivedDCmaturationandfunctionbyselectivelyinterferingwiththegenerationofimmatureDCs:centralroleofMSC-derivedprostaglandinE2.Blood.2009；113(26):6576-83.)，从而抑制免疫细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞、抗原呈递细胞等)的功能(可参见：CorcioneA,BenvenutoF,FerrettiE,GiuntiD,CappielloV,CazzantiF,etal.HumanmesenchymalstemcellsmodulateB-cellfunctions.Blood.2006；107(1):367-72.以及DiNicolaM,CarloStellaC,MagniM,MilanesiM,LongoniPD,MatteucciP,etal.HumanbonemarrowstromalcellssuppressT-lymphocyteproliferationinducedbycellularornonspecificmitogenicstimuli.Blood.2002；99(10):3838-43.)。外泌体(exosome)是一种由细胞分泌的直径约30～100nm，密度范围在1.13～1.19g/ml之间的膜性微囊泡。外泌体可携带多种与源细胞相似的蛋白质、mRNA、miRNA，参与免疫调节、细胞通讯、细胞迁移、血管新生等过程(可参见：Yanez-MoM,SiljanderPR,AndreuZ,ZavecAB,BorrasFE,BuzasEI,etal.Biologicalpropertiesofextracellularvesiclesandtheirphysiologicalfunctions.Journalofextracellularvesicles.2015；4:27066.)。Lai等发现MSCs来源的外泌体可减少心肌缺血再灌注损伤，并且证实外泌体的miRNA可以促进血管新生，因此外泌体可能成为治疗心血管疾病的一个新方向(可参见：LaiRC,ArslanF,LeeMM,SzeNS,ChooA,ChenTS,etal.ExosomesecretedbyMSCreducesmyocardialischemia/reperfusioninjury.Stemcellresearch.2010；4(3):214-22.)。Xin等发现MSCs来源的外泌体通过转移miR-133b到神经细胞，可促进神经轴突的生长(可参见：XinH,LiY,BullerB,KatakowskiM,ZhangY,WangX,etal.ExosomemediatedtransferofmiR-133bfrommultipotentmesenchymalstromalcellstoneuralcellscontributestoneuriteoutgrowth.Stemcells.2012；30(7):1556-64.)。Filipazzi等发现肿瘤细胞来源的外泌体可通过NK细胞激活型受体NKG2D(naturalkillergroup2,memberD)抑制T细胞和NK细胞的细胞毒性，从而影响宿主的免疫系统(可参见：FilipazziP,BurdekM,VillaA,RivoltiniL,HuberV.Recentadvancesontheroleoftumorexosomesinimmunosuppressionanddiseaseprogression.Seminarsincancerbiology.2012；22(4):342-9.)。外泌体(exosome)这种由活细胞分泌的膜泡，最早于1983年被发现。随着研究深入，发现其具有执行蛋白、核酸的运输，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件，参与细胞间的通讯等功能，而不断受到重视。外泌体携带蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。前者可能与外泌体的生物发生和生物学作用有关，主要包括：细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白；另一类是特殊蛋白质，这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的外泌体，而这些特定细胞源的外泌体与其生物学功能有着密切联系，例如：分子来源的外泌体上含有MHCII类分子。因此，不同细胞源的外泌体所携带的信号分子不一样，发挥的功能也不尽相同。例如：肿瘤细胞分泌的外泌体能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸，而树突状细胞源性外泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。目前研究发现，外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，并且外泌体能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故外泌体有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。目前研究发现，脐带血间充质干细胞来源的外泌体携带有多种有效的细胞因子、蛋白和小分子核酸物质，可有效介导细胞增殖、凋亡和功能调节作用。研究发现，外泌体中含有血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板增殖因子、肿瘤坏死因子和肿瘤生长因子等，具有抑制细胞凋亡、细胞的纤维化程度，促进血管发生有丝分裂和介导免疫反应等功能。实验证明，在使用间充质干细胞所分泌的外泌体携带的胰岛素样生长因子和血管内皮细胞生长因子是治疗急性肾损伤的关键主导因子。在免疫学方面，间充质干细胞分泌的外泌体脂膜表面表达有多种膜蛋白，如：凝血因子、肿瘤坏死因子、MHCI/II分子以及CCR5趋化因子受体等，这些脂膜表面蛋白对抵抗炎症具有重要的作用。目前进行外泌体提取的方式和途径也多种多样，如：骨髓中提取、外周血中提取等，这些外泌体获取的途径均需要有创伤性的细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
从人脐带血间充质干细胞中分离提取外泌体的方法，该方法包括：(1)、脐带血间充质干细胞的培养，和(2)、脐带血MSC外泌体的提取；其中所述脐带血间充质干细胞的培养是使脐带血间充质干细胞培养至P3代；所述脐带血MSC外泌体的提取包括如下步骤：2.1、外泌体悬液预处理2.1.1、外泌体来源一：待P3代脐带血MSC汇合率达到75％～85％时，尽量收集培养瓶中的培养基，放入4℃冰箱待用；2.1.2、外泌体来源二：用PBS铺满已去除培养基的培养瓶，将装有PBS的脐带血MSC的P3代细胞培养瓶放入体积分数为5％CO2饱和湿度培养箱中进行培养，饥饿脐带血MSC细胞24h，之后收集培养瓶中的PBS；2.1.3、外泌体来源三：2.1.3.1、PBS饥饿后的P3代脐带血MSC，通过加入0.25％胰蛋白酶‑0.01％EDTA消化液，将培养瓶中的细胞消化下来并收集到新离心管内，用PBS稀释定容，取500μl细胞悬液血球仪计数；2.1.3.2、取脐带血MSC的P3细胞，转移至新的离心管内，进行离心300*g，10min，升速度9，降速度7；2.1.3.3、去除上清液，用PBS重悬细胞，离心并且重复加入PBS洗涤；2.1.3.4、洗涤后去除PBS，向细胞沉淀加入具有缓冲作用的细胞裂解液，并且在低温冰袋上孵育30min，期间每隔5min，在旋窝振荡器上混匀1min，共振荡4次；2.1.3.5、孵育结束，再次离心20000*g，30min，升速度9，降速度7，提取全部上清液转移至新的离心管内，用PBS稀释，放入‑80℃冰箱低温保存至少24h；2.1.4、将2.1.3.5中的悬液复苏并与前面2.1.1步骤中的培养基、前面2.1.2从培养瓶中收集的PBS进行混合，作为外泌体来源混合液，用于共同提取外泌体；2.2、外泌体提取2.2.1、用PBS对外泌体来源混合液进行体积比1:1稀释，配平，进行离心，转速350*g，15min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余MSC细胞；2.2.2、小心将离心后的上清收集到新的离心管中，去除沉淀，离心，转速2500*g，20min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余死细胞；2.2.3、再次将上清收集到新的离心管中，弃沉淀，并再次离心13000*g，30min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余细胞碎片；2.2.4、轻轻将离心后的上清收集到新的离心管内，并进行超高速离心，转速110000*g，2h，升速度9，降速度7，4℃，所得沉淀物为外泌体中间产物；2.2.5、弃上清，用PBS稀释沉淀物，作为外泌体中间产物，通过0.22μm过滤器过滤悬液；2.2.6、在一个新的50ml离心管底部加入配置好的的TRIS/蔗糖/D2O溶液，形成缓冲垫；以5～6倍缓冲垫体积将悬液轻轻加在缓冲垫上方，避免冲破液面；再次进行超高速离心，转速100000*g，80min，升速度9，降速度9，4℃；2.2.7、弃上清，用18G针头的5ml注射器收集含有外泌体的缓冲垫，将缓冲垫用PBS稀释10倍，进行高速离心100000*g，60min，升速度9，将速度7，4℃；离心后尽量去除上清液，沉淀即为外泌体，用PBS重悬外泌体进行清洗，并进行高速离心100000*g，20min，去除上清液，再用PBS重复清洗外泌体、如上高速离心2‑3次；最终用PBS稀释并混匀，得到最终外泌体，任选的将其放入‑80℃冰箱低温保存。...

【技术特征摘要】
1.从人脐带血间充质干细胞中分离提取外泌体的方法，该方法包括：(1)、脐带血间充质干细胞的培养，和(2)、脐带血MSC外泌体的提取；其中所述脐带血间充质干细胞的培养是使脐带血间充质干细胞培养至P3代；所述脐带血MSC外泌体的提取包括如下步骤：2.1、外泌体悬液预处理2.1.1、外泌体来源一：待P3代脐带血MSC汇合率达到75％～85％时，尽量收集培养瓶中的培养基，放入4℃冰箱待用；2.1.2、外泌体来源二：用PBS铺满已去除培养基的培养瓶，将装有PBS的脐带血MSC的P3代细胞培养瓶放入体积分数为5％CO2饱和湿度培养箱中进行培养，饥饿脐带血MSC细胞24h，之后收集培养瓶中的PBS；2.1.3、外泌体来源三：2.1.3.1、PBS饥饿后的P3代脐带血MSC，通过加入0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化液，将培养瓶中的细胞消化下来并收集到新离心管内，用PBS稀释定容，取500μl细胞悬液血球仪计数；2.1.3.2、取脐带血MSC的P3细胞，转移至新的离心管内，进行离心300*g，10min，升速度9，降速度7；2.1.3.3、去除上清液，用PBS重悬细胞，离心并且重复加入PBS洗涤；2.1.3.4、洗涤后去除PBS，向细胞沉淀加入具有缓冲作用的细胞裂解液，并且在低温冰袋上孵育30min，期间每隔5min，在旋窝振荡器上混匀1min，共振荡4次；2.1.3.5、孵育结束，再次离心20000*g，30min，升速度9，降速度7，提取全部上清液转移至新的离心管内，用PBS稀释，放入-80℃冰箱低温保存至少24h；2.1.4、将2.1.3.5中的悬液复苏并与前面2.1.1步骤中的培养基、前面2.1.2从培养瓶中收集的PBS进行混合，作为外泌体来源混合液，用于共同提取外泌体；2.2、外泌体提取2.2.1、用PBS对外泌体来源混合液进行体积比1:1稀释，配平，进行离心，转速350*g，15min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余MSC细胞；2.2.2、小心将离心后的上清收集到新的离心管中，去除沉淀，离心，转速2500*g，20min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余死细胞；2.2.3、再次将上清收集到新的离心管中，弃沉淀，并再次离心13000*g，30min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余细胞碎片；2.2.4、轻轻将离心后的上清收集到新的离心管内，并进行超高速离心，转速110000*g，2h，升速度9，降速度7，4℃，所得沉淀物为外泌体中间产物；2.2.5、弃上清，用PBS稀释沉淀物，作为外泌体中间产物，通过0.22μm过滤器过滤悬液；2.2.6、在一个新的50ml离心管底部加入配置好的的TRIS/蔗糖/D2O溶液，形成缓冲垫；以5～6倍缓冲垫体积将悬液轻轻加在缓冲垫上方，避免冲破液面；再次进行超高速离心，转速100000*g，80min，升速度9，降速度9，4℃；2.2.7、弃上清，用18G针头的5ml注射器收集含有外泌体的缓冲垫，将缓冲垫用PBS稀释10倍，进行高速离心100000*g，60min，升速度9，将速度7，4℃；离心后尽量去除上清液，沉淀即为外泌体，用PBS重悬外泌体进行清洗，并进行高速离心100000*g，20min，去除上清液，再用PBS重复清洗外泌体、如上高速离心2-3次；最终用PBS稀释并混匀，得到最终外泌体，任选的将其放入-80℃冰箱低温保存。2.根据权利要求1的方法，其中所述脐带血间充质干细胞的培养包括如下步骤：1.1、脐带血的采集：选取足月新生儿的脐带，将其中的脐带血采集到一次性无菌塑料采血袋中，低温保鲜贮运；1.2、脐带血预处理：将采集到的脐带血，通过100μm孔径的过滤器转移至新的离心管中，以去除多余血块；1.3、脐带血单个核细胞提取：1.3.1、将过滤后的脐带血与PBS按1:1比例混匀得到细胞悬液，再取细胞悬液加入装有Ficoll分离液的离心管内，细胞悬液与Ficoll分离液体积比为5：3，进行离心2000rpm/min，30min，4℃，升速度1，降速度0；Ficoll分离液离心后，液面分为四层，依次是：红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、脐带血单个核细胞层、血浆层；1.3.2、用移液管尽量吸尽脐带血单个核细胞层，转移至装有脐带血MSC培养基1的离心管内并混匀，得悬液；另外将血浆层提取到另一个离心管中备用，用于MSC培养基配置；1.3.3、用0.22μm孔径的过滤器将悬液进行过滤，以除去多余淋巴细胞及杂质，得到细胞悬液；1.4、脐带血MSC的P0代培养1.4.1、将细胞悬液接种于T25培养瓶内，再加入10ml脐带血MSC培养基1，将T25培养瓶置于体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中进行培养；1.4.2、待原代细胞接种48h左右，向T25培养瓶中加入3ml脐带血MSC培养基1，之后每隔2-3天，加一次液，总共加3-4次培养基；之后每隔3天，去除原来的培养基，加入15ml脐带血MSC培养基1，对细胞进行换液处理，总共换液2-3次；1.5、脐带血MSC的P1-P3代培养1.5.1、待脐带血MSC原代细胞汇合率达到40％-50％时，做P0代传P1代处理，吸弃T25瓶中原有的培养基，吸取10ml的PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，洗涤完毕去除PBS缓冲液；加入0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化液1ml，浸漫覆盖T25培养瓶底部，再将培养瓶放置于CO2培养箱中孵育30-60s，轻轻拍打培养瓶侧面，倒置显微镜下观察，待MSC细胞皱缩成圆形，成流沙状漂浮时，加入5ml脐带血MSC培养基1进行终止消化，用5ml移液管充分吹打培养瓶底部并收集细胞于15ml离心管内；进行离心1400rpm/min，5min，4℃，升速度9，降速度7；1.5.2、离心后，弃去上清，用5ml的IMDM基础培养基重悬细胞，吸取200μl细胞悬液并用ADAM计数仪计数，按照3500-5000细胞/cm2密度接种于T75培养瓶中，并加入新的脐带血MSC培养基2，置于体积分数为5％CO2饱和湿度培养箱中进行培养，记为脐带血MSC的P1代细胞；1.5.3、待细胞汇合率达到80-90％时，重复上述操作，将脐带血MSC进行P2、P3代细胞扩增。3.根据权利要求1的方法，其包括如下步骤：(1)、脐带血间充质干细胞的培养，其包括如下步骤：1.1、脐带血的采集：选取足月新生儿的脐带，将其中的脐带血采集到一次性无菌塑料采血袋中，低温保鲜贮运；1.2、脐带血预处理：将采集到的脐带血，通过100μm孔径的过滤器转移至新的离心管中，以去除多余血块；1.3、脐带血单个核细胞提取：1.3.1、将过滤后的脐带血与PBS按1:1比例混匀得到细胞悬液，再取细胞悬液加入装有Ficoll分离液的离心管内，细胞悬液与Ficoll分离液体积比为5：3，进行离心2000rpm/min，30min，4℃，升速度1，降速度0；Ficoll分离液离心后，液面分为四层，依次是：红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、脐带血单个核细胞层、血浆层；1.3.2、用移液管尽量吸尽脐带血单个核细胞层，转移至装有脐带血MSC培养基1的离心管内并混匀，得悬液；另外将血浆层提取到另一个离心管中备用，用于MSC培养基配置；1.3.3、用0.22μm孔径的过滤器将悬液进行过滤，以除去多余淋巴细胞及杂质，得到细胞悬液；1.4、脐带血MSC的P0代培养1.4.1、将细胞悬液接种于T25培养瓶内，再加入10ml脐带血MSC培养基1，将T25培养瓶置于体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中进行培养；1.4.2、待原代细胞接种48h左右，向T25培养瓶中加入3ml脐带血MSC培养基1，之后每隔2-3天，加一次液，总共加3-4次培养基；之后每隔3天，去除原来的培养基，加入15ml脐带血MSC培养基1，对细胞进行换液处理，总共换液2-3次；1.5、脐带血MSC的P1-P3代培养1.5.1、待脐带血MSC原代细胞汇合率达到40％-50％时，做P0代传P1代处理，吸弃T25瓶中原有的培养基，吸取10ml的PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，洗涤完毕去除PBS缓冲液；加入0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化液1ml，浸漫覆盖T25培养瓶底部，再将培养瓶放置于CO2培养箱中孵育30-60s，轻轻拍打培养瓶侧面，倒置显微镜下观察，待MSC细胞皱缩成圆形，成流沙状漂浮时，加入5ml脐带血MSC培养基1进行终止消化，用5ml移液管充分吹打培养瓶底部并收集细胞于15ml离心管内；进行离心1400rpm/min，5min，4℃，升速度9，降速度7；1.5.2、离心后，弃去上清，用5ml的IMDM基础培养基重悬细胞，吸取200μl细胞悬液并用ADAM计数仪计数，按照3500-5000细胞/cm2密度接种于T75培养瓶中，并加入新的脐带血MSC培养基2，置于体积分数为5％CO2饱和湿度培养箱中进行培养，记为脐带血MSC的P1代细胞；1.5.3、待细胞汇合率达到80-90％时，重复上述操作，将脐带血MSC进行P2、P3代细胞扩增；(2)脐带血MSC外泌体的提取，其包括如下步骤：2.1、外泌体悬液预处理2.1.1、外泌体来源一：待P3代脐带血MSC汇合率达到75％～85％时，尽量收集培养瓶中的培养基，放入4℃冰箱待用；2.1.2、外泌体来源二：用PBS铺满已去除培养基的培养瓶，将装有PBS的脐带血MSC的P3代细胞培养瓶放入体积分数为5％CO2饱和湿度培养箱中进行培养，饥饿脐带血MSC细胞24h，之后收集培养瓶中的PBS；2.1.3、外泌体来源三：2.1.3.1、PBS饥饿后的P3代脐带血MSC，通过加入0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化液，将培养瓶中的细胞消化下来并收集到新离心管内，用PBS稀释定容，取500μl细胞悬液血球仪计数；2.1.3.2、取脐带血MSC的P3细胞，转移至新的离心管内，进行离心300*g，10min，升速度9，降速度7；2.1.3.3、去除上清液，用PBS重悬细胞，离心并且重复加入PBS洗涤；2.1.3.4、洗涤后去除PBS，向细胞沉淀加入具有缓冲作用的细胞裂...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯迹，
申请(专利权)人：英科博雅生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32