一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质细胞及其诱导分化方法技术

本发明专利技术公开了一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞及其诱导分化方法，其是解离多能干细胞制备成细胞团块，悬浮培养，使多能干细胞形成拟胚体，将培养液更换为神经嵴细胞培养液，悬浮培养拟胚体，每天收集胚体更换培养液；培养一定时间后使拟胚体贴壁生长一定时间；再消化收集细胞；贴壁培养收集的细胞，并将培养液更换为间充质干细胞培养液，传代培养后检测间充质的细胞表型，即得。本发明专利技术解决成人来源间充质干细胞及其他非限定诱导途径多能干细胞来源的间充质干细胞异质性与混杂的缺点，获得的神经嵴谱系间充质干细胞具有更强的免疫调节与成骨分化能力；标准化诱导分化程序可保证不同批次间获得的细胞群具有良好的一致性。

A neural crest pedigree derived mesenchymal cells from pluripotent stem cells and their induced differentiation

The present invention discloses a kind of pluripotent stem cells from neural crest lineages of mesenchymal stem cells and their differentiation method, which is the dissociation of pluripotent stem cells prepared into cell suspension culture, the mass of pluripotent stem cells to form embryoid bodies, liquid culture medium was changed into neural crest cell suspension culture, embryoid body every day, collect the embryo culture medium was changed; after a certain period of training to embryoid considerate wall growth for a certain period; and then the cells were collected; the adherent cells were collected, and the culture medium replacement for mesenchymal stem cell culture medium, cell phenotype in cultured mesenchymal detection, i.e.. The invention solves the problem of adult mesenchymal stem cells and other non limit induced by means of pluripotent stem cells derived mesenchymal stem cell defect heterogeneity and hybrid neural crest lineages, the mesenchymal stem cells have stronger immune regulation and osteogenic differentiation ability; standardization program can ensure the differentiation between different batches the cell population obtained good agreement.

【技术实现步骤摘要】
一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质细胞及其诱导分化方法
本专利技术属于生物与医学领域，更具体地，本专利技术涉及一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞及其制备方法，包括使用特殊的培养条件和选择技术。本专利技术还涉及利用这群神经嵴谱系间充质干细胞的治疗方法或其临床应用。
技术介绍
间充质干细胞(MSCs)属于成体干细胞的一种，是在成人体内许多组织如骨髓、脐带血、脂肪和外周血等中都存在的一大类多能细胞，在正常时处于静止状态，当所在的组织或器官受到损伤时，他们可以迅速进入增殖状态并保持极大的增殖潜力，并分化为不同的细胞类型以修复受损组织。最先发现的一类MSCs是骨髓间充质干细胞(FriedensteinAJ,JEmbryolExpMorphol,1966,16(3):381-90)，其能在不同的诱导条件下向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经细胞、造血支持细胞等方向分化，具有典型的干细胞特点。由于MSCs具有易于分离扩增及具有多向分化潜能等优点，最早被认为是组织工程理想的种子细胞而成为研究热点。随后发现MSCs具有强大的免疫调节能力，更进一步推动了MSCs相关的研究，使其成为最有希望实现临床化的明星细胞之一。但MSCs难以规模化扩增及异质性是目前限制MSCs临床化应用的两大障碍。鉴于MSCs广泛的来源及异质性，为了规范MSCs相关的实验与临床治疗研究，国际间充质干细胞治疗委员会ISCT于2006年提出鉴定MSCs的三个标准：(1)细胞可以粘附于塑料培养器皿；(2)细胞表达特定的表面抗原，其中CD44，CD73，CD90，STRO-1和CD105/SH2阳性率>95％，CD11,CD14,CD34和CD45阳性率<2％；(3)细胞的多向分化潜能，即可以分化为软骨细胞、骨细胞及脂肪细胞等。但即使培养中的细胞完全符合ISCT所提出的三个标准，MSCs功能上的差异也相当明显，直接导致MSCs表现出增殖能力、分化能力等各方面的差异。在ClinicalTrials上登记的MSC临床研究中很大比例都因结果不稳定而不得不中止研究宣告失败，导致这种差异性结果及临床效果不佳的主要原因是MSCs为异质性细胞群体，不同个体、不同组织来源、甚至同一组织提取到的MSCs都为包含多种亚型的异质性群体，不同亚型的MSCs功能各异。Anokhina通过将MSCs体外扩增50代，比较MSCs的异质性，发现随着传代次数的增加，MSCs的异质性有所下降，不同个体MSCs表达相同的表面标志，说明体外扩增可以选择性地筛选MSCs亚群，但是MSCs的分化功能则产生了较大的差异。这些研究结果表明长期或大量体外扩增加于MSCs群体上的选择压力将极大地影响MSCs种群的构成、分化性能及治疗功效，导致不同甚至相反的结果。即使MSCs的表面表型没有可检测到的变化，MSCs在持续传代过程中也会丢失其多能性，或特异性地筛选出性能不佳的亚型。因此，区分不同亚群MSCs，进而筛选出在相关应用中起关键作用的MSCs亚群，消除其异质性的影响是目前将MSCs临床应用的关键技术之一。为解决MSCs的来源与扩增的问题，不少研究致力于将ES及iPS诱导分化为MSCs。据文献报道，2004年ChunhuiXu最早通过转染humantelomerasereversetranscriptase(hTERT)基因至分化中的hESCs诱导ESC向HEF方向分化，得到的细胞有成骨分化的能力。但其未进行MSC的详细鉴定。随后TizianoBarberi通过与mouseOP9cellline共培养40d，在添加了20％FBS的alphaMEM培养液中诱导ESC向MSC分化，流式分选CD73+细胞，被视为是第一个诱导多能干细胞向MSC分化的报道。05年通过OP9细胞共培养得到MSC的课题组，08年报道了非共培养的诱导：人ESCs(H1、H7、及H9细胞株)培养于包被了Matrigel的孔板中，为了诱导其向MSC分化，增加换液周期为3-5d。9-10d后，40％-50％的细胞表现出成纤维样形态，机械去除ESC细胞，胶原酶消化分化的细胞并接入Matrigel包被的新皿中。成纤维细胞进一步增加，第二次刮去未分化细胞，胰酶消化并接入明胶包被的皿中，在加了10％FBS的aMEM中培养，约4-6周的时间可以完成诱导。Lian2007年报道了一种临床级的ES来源MSC，其通过胰酶消化ESC，以含bFGF及PDGF的KSR培养基在明胶包被的培养皿中培养，长满后胰酶消化传代，一周后以CD105+与CD24-分选得到MSC细胞。已有专利也记载了从iPS分化为间质细胞的方法，如美国杰龙公司(专利申请公布号CN101696397A)、国内付清玲(专利申请公布号CN105754936A)等都描述了一种从多能干细胞分化为间质细胞的方法。但是，这些文献或专利报道的方法得到的细胞未控制分化路径，只着重于解决MSCs的来源问题，未针对细胞的异质性提供相应的解决方案，因此诱导所得的细胞可能比骨髓来源的间充质更为异质；同时，这些方案未将细胞的功能作为重点考察对象，而治疗效果不佳的产品必定会极大地限制其应用。
技术实现思路
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞及其诱导方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，包括以下步骤：(1)体外贴壁培养多能干细胞，保持其未分化状态；(2)当(1)中细胞扩增到所需数量后，将细胞制备成细胞团块，悬浮培养，使多能干细胞形成拟胚体；(3)将培养液更换为神经嵴细胞培养液，悬浮培养拟胚体；每天或2～4天更换一次培养液；(4)悬浮培养4～10天后，贴壁培养拟胚体，每天或2～4天更换一次培养液；(5)生长2～10天后，以EDTA或胰酶消化收集细胞；(6)贴壁培养收集的细胞，并将培养液更换为间充质干细胞培养液，传代培养2～6次后检测间充质的细胞表型，即得；在其中一些实施例中，步骤(1)中每个拟胚体所含有的细胞数目为2×102～2×106。在其中一些实施例中，步骤(2)所述细胞团块可使用解离试剂如Dispase、Accutase或EDTA制备；解离试剂的作用温度为30～37℃。在其中一些实施例中，步骤(2)所述细胞团块也可使用机械划刮的方法制备。在其中一些实施例中，步骤(3)所述神经嵴细胞培养液包括以下组分：DMEM/F12:20-80％、Neuralbasal:20-80％。在其中一些实施例中，步骤(3)所述神经嵴细胞培养液还包括以下组分的一种或几种：N2:0.1-2％、B27:0.1-2％、L-Glu:0.1-5％、2-Mercaptoethanol:0.01mM-1mM、SB431542:0.01mM-1mM、BIO:0.1-10ng/ml、bFGF:2-50ng/ml、EGF:2-50ng/ml、Penicillin-Streptomycin:50-200U/ml。在其中一些实施例中，步骤(4)所述贴壁培养为：将拟胚体转移至包被了Matrigel或层粘连蛋白等基质胶的表面以促进拟胚体的贴壁。在其中一些实施例中，步骤(5)还包括使用P75与HNK1抗体标记收本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)体外贴壁培养多能干细胞，保持其未分化状态；(2)当(1)中细胞扩增到所需数量后，将细胞制备成细胞团块，悬浮培养细胞团块，使多能干细胞形成拟胚体；(3)将培养液更换为神经嵴细胞培养液，悬浮培养拟胚体；每天或2～4天更换一次培养液；(4)悬浮培养4～10天后，贴壁培养拟胚体，每天或2～4天更换一次培养液；(5)贴壁培养2～10天后，以EDTA或胰酶消化收集细胞；(6)贴壁培养收集的细胞，并将培养液更换为间充质干细胞培养液，传代培养2～6次后检测间充质的细胞表型，即得。

【技术特征摘要】
1.一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)体外贴壁培养多能干细胞，保持其未分化状态；(2)当(1)中细胞扩增到所需数量后，将细胞制备成细胞团块，悬浮培养细胞团块，使多能干细胞形成拟胚体；(3)将培养液更换为神经嵴细胞培养液，悬浮培养拟胚体；每天或2～4天更换一次培养液；(4)悬浮培养4～10天后，贴壁培养拟胚体，每天或2～4天更换一次培养液；(5)贴壁培养2～10天后，以EDTA或胰酶消化收集细胞；(6)贴壁培养收集的细胞，并将培养液更换为间充质干细胞培养液，传代培养2～6次后检测间充质的细胞表型，即得。2.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(2)中每个拟胚体所含有的细胞数目为2×102～2×106。3.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(2)所述细胞团块是使用解离试剂制备而得的；所述解离试剂为Dispase、Accutase或EDTA；所述解离试剂的作用温度为30～37℃。4.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(2)所述细胞团块是使用机械划刮的方法制备而得的。5.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(3)所述神经嵴细胞培养液包括以下组分...

【专利技术属性】
技术研发人员：项鹏，李伟强，翟志臣，
申请(专利权)人：广州赛隽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44