一种人牙髓干细胞培养基及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种人牙髓干细胞培养基及其制备方法，培养基包括基础培养基和添加物；基础培养基为α‑MEM培养基；添加物包括：体积百分含量为6‑12％的人AB血清、牛磺酸5‑10mg/L、硫辛酸0.1‑0.2mg/L、葡萄籽提取物2‑5mg/L、羧甲基壳聚糖0.6‑1.5g/L、葫芦素B 0.3‑0.8mg/L、血小板衍生生长因子1‑4μg/L、表皮生长因子1‑4μg/L、薯蓣皂苷元0.6‑1.8mg/L和、氯化胆碱50‑65μM。本发明专利技术通过特定组分组成，各组分协同作用，能够显著提高牙髓细胞的扩增速度，且不影响牙髓干细胞的多向分化能力，同时无人体免疫排斥反应，可为临床牙的修复与再生提供可靠的种子细胞。

A human dental pulp stem cell culture medium and its preparation method

The invention discloses a human dental pulp stem cell culture medium and its preparation method, culture medium including basic medium and additives; based medium additives include: alpha MEM; volume fraction is 6 12% human AB serum, 5 10mg/L, taurine lipoic acid 0.1 0.2mg/L, grape 2 seed extract 5mg/L, carboxymethyl chitosan, 1.5g/L 0.6 cucurbitacin B 0.3 0.8mg/L, platelet-derived growth factor 1 4 g/L, epidermal growth factor 1 4 g/L, 0.6 1.8mg/L and diosgenin, choline chloride 50 65 M. The present invention through specific components, each component of the synergistic effect, can significantly improve the amplification rate of dental pulp cells, and does not affect the differentiation of dental pulp stem cells, and no immune rejection, which can provide a reliable seed cells for the repair and regeneration of dental clinic.

【技术实现步骤摘要】
一种人牙髓干细胞培养基及其制备方法
本专利技术属于干细胞培养
，具体涉及一种人牙髓干细胞培养基及其制备方法。
技术介绍
干细胞是具有自我复制和多向分化能力的细胞，可以不断地自我更新，并在特定条件下分化成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞，可使组织恢复再生能力，修复其功能。研究者在脱落乳牙的牙髓组织中发现一种新的成体干细胞，将其命名为乳牙牙髓干细胞，至今已有较多实验证明乳牙牙髓干细胞具有高度自我更新、克隆形成以及成骨分化的能力。乳牙牙髓干细胞具有以下优势：1)取材方便，多取自自然脱落和拔除的滞留牙，对供者正常牙伤害较少；2)不受伦理限制，可进行自体移植治疗，最大限度降低免疫排斥和交叉感染的风险；3)具有较强的增殖能力和多向分化潜能。但牙髓中干细胞含量较低，必须在体外进行扩增，以获得足够的细胞数量来满足应用需求。目前，牙髓干细胞培养体系主要采用含动物源胎牛血清的培养基，动物源胎牛血清在一定程度上有可能引起人体免疫排斥反应，增加了牙髓干细胞临床应用的风险。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供了一种人牙髓干细胞培养基及其制备方法，该培养基制得的人牙髓干细胞产量高，无人体免疫排斥反应，为临床牙的修复与再生提供了可靠的种子细胞。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种人牙髓干细胞培养基，包括基础培养基和添加物；基础培养基为α-MEM培养基；添加物包括：体积百分含量为6-12％的人AB血清、牛磺酸5-10mg/L、硫辛酸0.1-0.2mg/L、葡萄籽提取物2-5mg/L、羧甲基壳聚糖0.6-1.5g/L、葫芦素B0.3-0.8mg/L、血小板衍生生长因子1-4μg/L、表皮生长因子1-4μg/L、薯蓣皂苷元0.6-1.8mg/L和氯化胆碱50-65μM。进一步地，添加物包括：体积百分含量8-10％的人AB血清、牛磺酸6-8mg/L、硫辛酸0.12-0.18mg/L、葡萄籽提取物3-5mg/L、羧甲基壳聚糖1.0-1.5g/L、葫芦素B0.4-0.6mg/L、血小板衍生生长因子2-3μg/L、表皮生长因子2-3μg/L、薯蓣皂苷元0.8-1.5mg/L和氯化胆碱55-63μM。进一步地，添加物包括：体积百分含量10％的人AB血清、牛磺酸7mg/L、硫辛酸0.15mg/L、葡萄籽提取物5mg/L、羧甲基壳聚糖1.2g/L、葫芦素B0.5mg/L、血小板衍生生长因子2μg/L、表皮生长因子2μg/L、薯蓣皂苷元1.2mg/L和氯化胆碱60μM。进一步地，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32-35％的水和0.03-0.08％的酵母，室温下密封发酵10-12天，然后真空干燥至含水量≤7％；(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60-62℃，萃取压力为3.8-4.0MPa，萃取时间为1-1.5h，得萃取物；(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/3-1/4，所得浓缩液以0.6-0.8V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。进一步地，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32％的水和0.03％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含水量≤7％；(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60℃，萃取压力为3.8MPa，萃取时间为1.5h，得萃取物；(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.6V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。上述培养基的制备方法，包括：向基础培养基中加入人AB血清、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、牛磺酸、硫辛酸和氯化胆碱，搅拌30-40min，然后再加入羧甲基壳聚糖、葫芦素B和薯蓣皂苷元，继续搅拌30-40min，静置1.5-2h，最后加入籽葡萄提取物，搅拌30-40min，得混合物，调节混合物的pH值值6.8-7.2，然后过滤除菌，制得。进一步地，用0.22μm滤膜过滤除菌。本专利技术提供的人牙髓干细胞培养基及其制备方法，具有以下有益效果：在本专利技术中，血小板衍生生长因子和表皮生长因子主要作为维持牙髓细胞体外培养生存、增殖和分化所需的补充因子；牛磺酸和硫辛酸可协同进一步促进牙髓细胞的增殖，同时硫辛酸与籽葡萄提取物可协同起到抗氧化作用；羧甲基壳聚糖可与牛磺酸和硫辛酸协同起到增殖作用，加入葫芦素B更能显著提高牙髓细胞的增殖作用，同时羧甲基壳聚糖还能起到稳定剂的作用。本专利技术通过特定组分组成，各组分协同作用，能够显著提高牙髓细胞的扩增速度，且不影响牙髓干细胞的多向分化能力，同时无人体免疫排斥反应，可为临床牙的修复与再生提供可靠的种子细胞。具体实施方式实施例1一种人牙髓干细胞培养基，包括基础培养基和添加物；基础培养基为α-MEM培养基；添加物包括：体积百分含量为6％的人AB血清、牛磺酸5mg/L、硫辛酸0.1mg/L、葡萄籽提取物2mg/L、羧甲基壳聚糖0.6g/L、葫芦素B0.3mg/L、血小板衍生生长因子1μg/L、表皮生长因子1μg/L、薯蓣皂苷元0.6mg/L和氯化胆碱50μM。其中，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32％的水和0.03％的酵母，室温下密封发酵10天，然后真空干燥至含水量≤7％；(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60℃，萃取压力为3.8MPa，萃取时间为1h，得萃取物；(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/3，所得浓缩液以0.6V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。上述培养基的制备方法，包括：向基础培养基中加入人AB血清、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、牛磺酸、硫辛酸和氯化胆碱，搅拌30min，然后再加入羧甲基壳聚糖、葫芦素B和薯蓣皂苷元，继续搅拌30min，静置1.5h，最后加入籽葡萄提取物，搅拌30min，得混合物，调节混合物的pH值值6.8-7.2，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，制得。实施例2一种人牙髓干细胞培养基，包括基础培养基和添加物；基础培养基为α-MEM培养基；添加物包括：体积百分含量为12％的人AB血清、牛磺酸10mg/L、硫辛酸0.2mg/L、葡萄籽提取物5mg/L、羧甲基壳聚糖1.5g/L、葫芦素B0.8mg/L、血小板衍生生长因子4μg/L、表皮生长因子4μg/L、薯蓣皂苷元1.8mg/L和氯化胆碱65μM。其中，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量35％的水和0.08％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含水量≤7％；(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为62℃，萃取压力为4.8MPa，萃取时间为1.5h，得萃取物；(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.8V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。上述培养基的制备方法，包括：向基础培养基中加入人AB血清、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、牛磺酸、硫辛酸和氯化胆碱，搅拌40min，然后再加入羧甲基壳聚糖、葫芦素B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人牙髓干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加物；基础培养基为α‑MEM培养基；添加物包括：体积百分含量为6‑12％的人AB血清、牛磺酸5‑10mg/L、硫辛酸0.1‑0.2mg/L、葡萄籽提取物2‑5mg/L、羧甲基壳聚糖0.6‑1.5g/L、葫芦素B 0.3‑0.8mg/L、血小板衍生生长因子1‑4μg/L、表皮生长因子1‑4μg/L、薯蓣皂苷元0.6‑1.8mg/L和氯化胆碱50‑65μM。

【技术特征摘要】
1.一种人牙髓干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加物；基础培养基为α-MEM培养基；添加物包括：体积百分含量为6-12％的人AB血清、牛磺酸5-10mg/L、硫辛酸0.1-0.2mg/L、葡萄籽提取物2-5mg/L、羧甲基壳聚糖0.6-1.5g/L、葫芦素B0.3-0.8mg/L、血小板衍生生长因子1-4μg/L、表皮生长因子1-4μg/L、薯蓣皂苷元0.6-1.8mg/L和氯化胆碱50-65μM。2.根据权利要求1所述的人牙髓干细胞培养基，其特征在于，添加物包括：体积百分含量8-10％的人AB血清、牛磺酸6-8mg/L、硫辛酸0.12-0.18mg/L、葡萄籽提取物3-5mg/L、羧甲基壳聚糖1.0-1.5g/L、葫芦素B0.4-0.6mg/L、血小板衍生生长因子2-3μg/L、表皮生长因子2-3μg/L、薯蓣皂苷元0.8-1.5mg/L和氯化胆碱55-63μM。3.根据权利要求1或2所述的人牙髓干细胞培养基，其特征在于，添加物包括：体积百分含量10％的人AB血清、牛磺酸7mg/L、硫辛酸0.15mg/L、葡萄籽提取物5mg/L、羧甲基壳聚糖1.2g/L、葫芦素B0.5mg/L、血小板衍生生长因子2μg/L、表皮生长因子2μg/L、薯蓣皂苷元1.2mg/L和氯化胆碱60μM。4.根据权利要求1所述的人牙髓干细胞培养基，其特征在于，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32-35％的水和0.03-0.08％的酵母，室温下密封发酵10...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡小东，王健，赵翔，熊华强，宋彩霞，王仁杰，邱阳，黄启程，李国焱，唐玲，叶劲涛，曹玉昊，
申请(专利权)人：重庆斯德姆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50