人脐带间充质干细胞培养液中抗氧化活性成分的分离方法技术

本发明专利技术提供了一种从人脐带间充质干细胞培养液中分离出具有抗氧化功效的活性成分的方法。按照下述步骤进行该活性成分的制备：正常剖宫产手术或顺产过程中，无菌条件下取脐带，对脐带进行清洗消毒后除去血管和粘膜，剪碎脐带组织放入培养瓶中培养。取对数期生长的人脐带间充质干细胞培养液，采用不同规格的超滤离心管进行离心超率，最终获得具有抗氧化功效的分子量在10KDa～30KDa的分离物。此部分分离物可冻干制成冻干粉末，以方便存储使用。本发明专利技术提供的人脐带间充质干细胞培养液分离物具有良好的抗氧化活性，能够帮助细胞抵抗自由基的侵害，分离物来自于人体自身组织，安全性高，有望应用于药品、保健品、护肤品及其他日用化工品等产品中。本发明专利技术所提供的分离方法简单易行，成本低廉，无环境污染，适合工业化生产。

Separation of antioxidant components from human umbilical cord mesenchymal stem cell culture medium

The invention provides a method for separating active components with antioxidant effect from human umbilical cord mesenchymal stem cell culture medium. According to the following steps, the preparation of the active ingredient: the umbilical cord was taken under aseptic conditions during the normal caesarean operation or in the process of spontaneous production. The umbilical cord was cleaned and sterilized, and the blood vessels and mucous membrane were removed and the umbilical cord tissue was cut into the culture bottle. In the logarithmic phase of human umbilical cord mesenchymal stem cell culture, the centrifugation rate was carried out with different specifications of ultrafiltration centrifuge tubes, and the molecular weight of the molecular weight of 10KDa to 30KDa was obtained. This part can be freeze-dried to make freeze-dried powder for easy storage and use. The human umbilical cord mesenchymal stem cell culture fluid isolated from the human umbilical cord has good antioxidant activity and can help the cells to resist the invasion of free radicals. The isolate comes from human body tissue and has high safety. It is expected to be used in drugs, health care products, skin care products and other products of daily use. The separation method provided by the invention is simple and cheap, and has no environmental pollution, and is suitable for industrial production.

【技术实现步骤摘要】
人脐带间充质干细胞培养液中抗氧化活性成分的分离方法
本专利技术涉及一种从人脐带间充质干细胞培养液中分离制备一种分子量为10KDa～30KDa之间的具有抗氧化活性成分的方法，属于细胞及生物工程领域。
技术介绍
抗氧化剂可以减弱或祛除自由基对人体的损害，或者保护食品免受氧化损伤变质。科学研究表明，癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联。研究抗氧化可以有效克服其所带来的危害，所以抗氧化被药品、保健品、护肤品生产企业及其他日用化工生产企业列为研发方向之一，也是市场最重要的功能性诉求之一。化学合成抗氧化剂，如没食子酸丙酯、二丁基羟基甲苯等、DMEM乙内酰脲等，价格便宜，被广泛地应用于食品、日化等工业中。但是，化学合成的抗氧化剂具有不同程度的毒副作用，能够不同程度的损伤人体的肝脏、肾脏等器官，因而其在产品中的添加量被各国严格控制。来自于动植物组织中的天然的抗氧化剂将有效解决化学合成抗氧化剂的毒副作用问题。间充质干细胞（MSC）是目前实验室和临床研究最多的成体多能干细胞，在造血干细胞移植、移植物抗宿主病等中具有重要应用。根据来源可分为骨髓来源MSC（BMSC）、脂肪来源MSC和脐带来源MSC（hUCMSCs)。目前研究最多最为深入广泛的是BMSC，但由于当前人骨髓来源BMSC水平极低，且存在病毒感染率较高，细胞增殖分化潜能随年龄的增大而下降且穿刺取材是一个侵袭性、有创伤、易污染的操作，对其临床广泛应用带来限制。研究发现从人脐带中分离出的hUCMSCs，在细胞含量、增殖能力方面均优于BMSC，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，不表达或低表达免疫排斥相关标记，免疫原性比BMSC低，且取材方便，无伦理学争议，是目前认为较为理想的种子细胞。hUCMSCs细胞在采用贴壁法进行细胞培养时，细胞生物学特征稳定，污染机会少，研究表明12代以内的细胞间无增殖能力差异，增殖能力较强，在培养过程中能够分泌多种生长因子，如上皮细胞生长因子（EGF)、成纤维细胞生长因子（bFGF），转换生长因子（TGF）等。本专利技术旨在以抗氧化功能为导向，研究对数生长期人脐间充质干细胞培养液的有用成分并对其进行分离，该成分来源于人体组织，安全性高，抗氧化性能好，有望应用于药品、保健品及护肤品中。人脐间充质干细胞在培养过程中，会产生大量废弃的培养液，本专利技术还可提高这些废弃培养液的利用率，降低处理废弃培养液的成本、减轻废弃培养液对环境的污染、提高人脐间充质干细胞培养液的应用，具有一定的市场经济效益。
技术实现思路
本专利技术仅采用离心超滤的方法对对数生长期人脐间充质干细胞培养液的成分进行分离，并对各不同级分中所含有的有效成分进行了研究，结果发现，对数生长期人脐间充质干细胞培养液中的分子量为10KDa～30KDa之间的成分具有优异的抗氧化功能，它能有效清除DPPH自由基，羟基自由基及超氧阴离子自由基。该方法分离工艺简单，分离成本低廉，分离物有望应用于药品、保健品、护肤品等日用化工品中，制备成多种形式的产品。本专利技术提供的一种具有抗氧化活性的对数生长期人脐间充质干细胞培养液的分离物，制备步骤如下。步骤一：人脐带间充质干细胞的制备。（1）脐带的保存：正常剖宫产手术或顺产过程中，无菌条件下取脐带，将脐带存放于保存液中，4℃下储存备用。（2）脐带的清洗：从保存液中取出脐带放入灭菌容器中，加入生理盐水40ml～70ml，震荡漂洗20s～30s，转移到另一灭菌容器中；向该灭菌容器中加入40ml～70ml甲硝唑注射液浸泡5～7分钟，然后用生理盐水40ml～70ml将脐带再清洗一次，脐带清洗完成后，将其置于一次性使用无菌培养皿中。（3）人脐带间充质干细胞的制备：用镊子和剪刀剪去脐带中的血管和粘膜，并将其剪成肉糜状，将肉糜状组织转移至离心管中加入适量磷酸盐缓冲液，在1000rpm～1500rpm下离心5min洗涤1次，除去上清液，加入培养液10ml～15ml后，将组织悬液平分加入到两个培养瓶中，将培养瓶置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养3～5天。（4）人脐带间充质干细胞的传代培养：弃除培养基，加入Tryple，立即放入培养箱，消化8min后，待细胞全部脱落，加入终止液即培养基，吹散细胞，于1000rpm～1500rpm下离心5min；弃去上清，补加新的培养基，将培养瓶置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养3～5天。步骤二：抗氧化活性成分的分离。（1）对数生长期人脐带间充质干细胞培养液的搜集与储存：收集对数期人脐带间充质干细胞培养液，于1℃～5℃条件下保存备用。（2）抗氧化有效成分的分离与筛选：将对数期人脐带间充质干细胞培养液采用不同规格的超滤管进行离心超率，于1℃～5℃，2000g～5000g的条件下超滤收集各不同级分进行抗氧化实验，评估各不同级分的抗氧化效果，最终获得具有抗氧化功效的分子量为10KDa-30KDa之间的分离物。将具有抗氧化功效的成分进行分装，冻干备用。步骤三：分离物抗氧化活性的测定。（1）清除DPPH自由基能力的测定。取分离物冻干粉配制成不同浓度的样品溶液，测定分离物对DPPH自由基的清除能力。具体步骤为：向离心管中分别加入2mL不同浓度梯度的样品溶液，再分别加入2mLDPPH溶液（95%乙醇配制，0.1mmol/L），混合均匀后避光反应30分钟。在517nm处测定吸光值A。上述步骤不加入DPPH，向每个试管中加入2mL95%乙醇，其余步骤不变测得数据A1。向离心管中加入2mL纯化水和2mLDPPH溶液，其余步骤不变，测得吸光值A0。以纯化水为空白，每个样品做3个平行试验，取平均值，计算公式如下：DPPH自由基清除率=[1-(A-A1)/A0]×100%。（2）羟基自由基清除能力的测定。取分离物冻干粉配制成不同浓度的样品溶液，测定分离物对羟基自由基的清除能力。实验步骤如下：在10mL的离心管中分别加入0.5mL配好的邻二氮菲溶液，1mL磷酸缓冲液，0.5mL不同浓度的样品溶液，加入0.5mL0.75mmol/LFeSO4溶液，混匀后再加入H2O2溶液0.5mL，在536nm处测定吸光度Ax；将上述步骤中样品溶液换为蒸馏水，其余不变，测定吸光度Af；将上述步骤中H2O2溶液换为蒸馏水，其余步骤不变测定吸光度A0；不加入H2O2，其余步骤不变，测定吸光度As。以纯化水为空白，每个样品做3个平行试验，取平均值，计算公式如下：羟基自由基清除率=（As-Ax）/(A0-Af)×100%。（3）超氧阴离子自由基清除能力的测定。采用邻苯三酚自氧化法。取分离物冻干粉配制成不同浓度的样品溶液，取0.1mL样品溶液加入2.8mL的0.1mol/LpH8.2的Tris-Hcl缓冲溶液，以0.1mL纯化水代替样品溶液作为空白对照。震荡混匀混合溶液，在25℃水浴保温10分钟后加入0.1mL3mmol/L的事先在25℃水浴锅中预热的邻苯三酚溶液，迅速混匀并开始计时，在325nm处测定A，每隔30s读取A325，4.5分钟后结束，以空白对照调零。做吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V，按照下式计算计算样品对超氧阴离子的抑制率：抑制率（%）=（V对照-V样品）/V对照×100。本专利技术提供的人脐带间充质干细胞培养液中的抗氧化活性成分对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子本文档来自技高网...

【技术保护点】
从人脐带间充质干细胞培养液中分离制备具有抗氧化功效的活性成分，其方法包括以下步骤：步骤一：人脐带间充质干细胞的制备：（1）脐带的保存：正常剖宫产手术或顺产过程中，无菌条件下取脐带，将脐带存放于保存液中，4℃下储存备用；（2）脐带的清洗：从保存液中取出脐带放入灭菌容器中，加入生理盐水40 ml～70 ml，震荡漂洗20s～30s，转移到另一灭菌容器中；向该灭菌容器中加入40 ml～70 ml甲硝唑注射液浸泡5～7分钟，然后用生理盐水40 ml～70 ml将脐带再清洗一次，脐带清洗完成后，将其置于一次性使用无菌培养皿中；（3）人脐带间充质干细胞的制备：用镊子和剪刀剪去脐带中的血管和粘膜，并将其剪成肉糜状，将肉糜状组织转移至离心管中加入适量磷酸盐缓冲液，在1000 rpm～1500 rpm下离心5 min洗涤1次，除去上清液，加入培养液10 ml～15 ml后，将组织悬液平分加入到两个培养瓶中，将培养瓶置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养3～5天；（4）人脐带间充质干细胞的传代培养：弃除培养基，加入Tryple，立即放入培养箱，消化8min后，待细胞全部脱落，加入终止液即培养基，吹散细胞，于1000 rpm～1500 rpm下离心5 min；弃去上清，补加新的培养基，将培养瓶置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养3～5天；步骤二：抗氧化活性成分的分离：（1）对数期人脐带间充质干细胞培养液的搜集与储存：收集对数期人脐带间充质干细胞培养液，于1℃～5℃条件下保存备用；（2）抗氧化有效成分的分离与筛选：将对数期人脐带间充质干细胞培养液采用不同规格的超滤管进行离心超率，于1℃～5℃，2000g～5000g的条件下超滤收集各不同级分进行抗氧化实验，评估各不同级分的抗氧化效果，最终获得具有抗氧化功效的分子量为10KDa‑30KDa之间的分离物。...

【技术特征摘要】
1.从人脐带间充质干细胞培养液中分离制备具有抗氧化功效的活性成分，其方法包括以下步骤：步骤一：人脐带间充质干细胞的制备：（1）脐带的保存：正常剖宫产手术或顺产过程中，无菌条件下取脐带，将脐带存放于保存液中，4℃下储存备用；（2）脐带的清洗：从保存液中取出脐带放入灭菌容器中，加入生理盐水40ml～70ml，震荡漂洗20s～30s，转移到另一灭菌容器中；向该灭菌容器中加入40ml～70ml甲硝唑注射液浸泡5～7分钟，然后用生理盐水40ml～70ml将脐带再清洗一次，脐带清洗完成后，将其置于一次性使用无菌培养皿中；（3）人脐带间充质干细胞的制备：用镊子和剪刀剪去脐带中的血管和粘膜，并将其剪成肉糜状，将肉糜状组织转移至离心管中加入适量磷酸盐缓冲液，在1000rpm～1500rpm下离心5min洗涤1次，除去上清液，加入培养液10ml～15ml后，将组织悬液平分加入到两个培养瓶中，将培养瓶置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养3～5天；（4）人脐带间充质干细胞的传代培养：弃除培养基，加入Tryple，立即放入培养箱，消化8min后，待细胞全部脱落，加入终止液即培养基，吹散细胞，于1000rpm～1500rpm下离心5min；弃去上清，补加新的培养基，将培养瓶置于3...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓勇，王余，江振华，
申请(专利权)人：武汉北度生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42