治疗剂制造技术

本发明专利技术涉及制备一种用于治疗损伤，突出或其它异常的哺乳动物椎间盘中所用的改良药物组合物制剂的木瓜凝乳蛋白酶的方法。该方法包括一个酸沉淀步骤，并且最好有一个使用直接基质的活性位点的亲合色谱方法。（*该技术在2010年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及木瓜凝乳蛋白酶，改进的含有木瓜凝乳蛋白酶的药物组合物，以及治疗脊椎动物椎间的损伤的，突出的或异常的椎间盘的方法。该方法包括将一种改进的组合物溶液注入所说的椎间盘。本专利技术还涉及制备本专利技术木瓜凝乳蛋白酶的方法，和用于这些方法中的肽和亲合色谱法的基质，以及抗木瓜凝乳蛋白酶培养的单一特异抗体制剂。木瓜凝乳蛋白酶是一种存在于巴婆(paw-paw)植物胶乳中的一种半胱氨酸蛋白酶。已知它可用于临床，特别是在周知的“化学核溶解(chemonucleolysis)”中治疗椎间盘的脱垂或突出或坐骨神经痛，(smith，L.(1964)，J，Amer.Med.Assoc.187，137-140)。Jansen和Balls(1941)首先尝试将木瓜凝乳蛋白酶纯化和表征它(J.Biol.chem.，137，405-417)。它们采用酸沉淀和盐析方法制备酶。近来，都使用离子交换色谱法进行纯化。例如，GB2098997(SmithLaboratoriesInc.)和GB2156821(Simmons)都描述了采用阳离子交换树脂从其它已知的半胱氨酸蛋白酶中分离木瓜凝乳蛋白酶，这些方法都已用于工业规模生产木瓜凝乳蛋白酶。但是所得产物与Buttle和Barrett(1984.Biochem.J.223，81～88)所制备的相比较，其比活度相当低，该方法使用小规模的多步法，中间结合阳离子交换色谱步骤。这种高比活度的产物，其产率极低，而且方法不宜用于工业规模。Buttle等人(Biochem.J.(1989.7月)261，469-476)发现，这种产物由一种新近分离和表征的蛋白酶，番木瓜蛋白酶Ⅳ所污染，这种酶和木瓜凝乳蛋白酶一起从阳率子交换树脂上共洗脱。阳离子交换色谱法不能从番木瓜蛋白酶中分离木瓜凝乳蛋白酶达到这样的程度以致能用于制备木瓜凝乳蛋白酶而基本上没有番木瓜蛋白酶Ⅳ的污染。文献中也有涉及到使用亲合色谱步骤的方法。Polgar(1981，Biochim，Biophys，Acta，658，262～269)描述了纯化木瓜凝乳蛋白酶的方法，在许多其它技术中，采用了在琼脂糖-汞化合物柱上的亲合色谱法，Dubois等人(Biol.Chem.Hoppe-Seyler(1988)，369，733-740)报导了采用类似的技术由番木瓜胶乳中分离半胱氨酸蛋白酶。这种亲合色谱法是基于键合到惰性基质的汞配位体和蛋白酶的暴露的硫醇基团之间的相互作用。因此，除了木瓜凝乳蛋白酶之外的蛋白质，尤其是其它半胱氨酸蛋白酶，如番木瓜蛋白酶Ⅳ，能结合到这种柱上并接着能和木瓜凝乳蛋白酶一起共洗脱。最近，科学论文报导了采用固定肽衍生物通过亲合色谱法来纯化特异蛋白酶，例如，人体组织蛋白酶(Rich等人，1986，Biochem.J.235，731-4)和由溶组织内阿来巴(Entamoebahistolytica)分离组织溶解酶(Luaces和Barrett，1988，Biochem.J.250，903-909)。然而，至今这种方法还没有用于纯化木瓜凝乳蛋白酶。因此，很明显，需要一种适用于工业规模的，纯化木瓜凝乳蛋白酶的改进方法。本专利技术人发现了一种新的纯化和分离高活性木瓜凝乳蛋白酶而没有污染的方法，特别是，没有番木瓜胶乳中的其它半胱氨酸蛋白酶(包括番木瓜蛋白酶Ⅳ)的污染。本专利技术提供了一种木瓜凝乳蛋白酶，它基本是纯的并含有高比率的活性酶。本专利技术的木瓜凝乳蛋白酶基本上不含存在于番木瓜胶乳中的免疫学上特殊的蛋白酶，即木瓜蛋白酶和番木瓜蛋白酶Ⅲ(PPIII)，这两种酶都由Buttle和Barrett((1984)，Biochem.J.，223，81～88.)描述，尤其近来发现的番木瓜蛋白酶Ⅳ(PPIV)。本文所用的“基本上纯”可以进一步定义为“基本上免疫学纯”是指本专利技术的木瓜凝乳蛋白酶与抗纯的PPIV所产生的特异抗体(由Buttle等人分离和表征的，见Biochem.J.(1989.7月)261，469～476而且在下文有简述)之间基本上没有任何交叉反应，以及与对木瓜蛋白酶和PPⅢ而培养的特异抗体(如上文Buttle和Barrett(1984)所述，同上文)基本上没有任何交叉反应。需要特别注意的是，发现按Buttle和Barrett方法制备的所谓“纯”木瓜凝乳蛋白酶含有明显量的PPⅣ(约14%)，因此最初由它们制备的抗木瓜凝乳蛋白酶抗体制剂对本专利技术纯化的木瓜凝乳蛋白酶和纯化的PPⅣ两者都具有特异性。优选的本专利技术木瓜凝乳蛋白酶中的各种PPⅣ、PPⅢ和木瓜蛋白酶的含量低于1%(重量)、更好的低于0.2%(重量)，最好的低于0.1%(重量)。抗本专利技术木瓜凝乳蛋白酶的单一特异抗体制剂是本专利技术的另一方面。在抗原和抗体之间的交叉反应可以用通常技术检测。这些技术包括如熔融火箭(fusedrocket)免疫电泳法和双向免疫扩散法(doubleimmunodiffusion)(由Buttle和Barrett描述，(1984)，同上文)，单一散射免疫测试法，放射免疫测试法(RIA)以及连接酶的免疫吸附剂测定法(ELISA)。任何酶制剂中的所含活性酶的量一般是指，在指定测定条件下，对一种特定的基质的比活性。本文所用的“对BAPNA的比活性”是指在标准测定条件下用合成基质N-α-苯甲酰基-DL-精氨酸对-硝基酰苯胺(BAPNA)测定时，按每毫克干产物每秒所产生的对硝基酰苯胺的皮摩尔数(pmol/sec/mg)表示的蛋白酶活性。对已知木瓜凝乳蛋白酶药物制剂所用的标准测定条件详细描述于下文，如“BAPNA测定方法1”或“Smith测定方法”以及由此得到的比活性是指在37℃pH6时，对BAPNA(1mM)的比活性。本专利技术的木瓜凝乳蛋白酶定义为，在37℃和pH6.0时，对BAPNA(1mM)的比活性至少为750单位每毫克。一般，本专利技术的木瓜凝乳蛋白酶，在37℃和pH6时，对BAPNA(mM)的比活性为800～1700单位每毫克，优选的为1000-1700单位每毫克，如1200-1500单位每毫克。在本专利技术的一个优选方案提供一种在37℃pH6.0时具有至少1300单位每毫克的对BAPNA(1mM)的比活性的木瓜凝乳蛋白酶。在大量涉及木瓜凝乳蛋白酶和其它半胱氨酸蛋白酶的文献中，蛋白酶活性广泛地定义是根据由合成基质BAPNA中所释放的对一硝基苯胺。当在所引用的比活性值之间进行直接比较时仍可遇到问题。要取得精确值决定于许多因数，特别是涉及精确的条件，如在测定中所用的pH值、温度、缓冲剂组份和基质浓度。由Buttle和Barrett(1984，同上文)所制备的木瓜凝乳蛋白酶在其文中所引用的抗BAPNA的比活性为0.154μmol/min/mg，相当于2567pmol/sec/mg。但是Buttle和Barrett所用的测定条件不同于已知的药物级木瓜凝乳蛋白酶所用的测定条件。因此不能直接比较比活性。因为Buttle和Barrett所制备的产物被认为在至今所报导的具有最高比活性的木瓜凝乳蛋白酶制剂，所以本专利技术的最初工作是按他们文献中所指定的测定条件进行。本文中将该方法以BAPNA测定方法2表示，由此得到的比活性是指在40℃和pH6.8时的抗BAPNA(2.5mM)的比活性。很明显，测定条件不同于木瓜本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化木瓜凝乳蛋白酶的方法，包括：Ａ．ａ）和一种直接亲合色谱基质的活性位点保温粗制木瓜凝乳蛋白酶的水溶液，该基质含有一种载体基质，任选地通过间隔段而共价偶合到可逆的木瓜凝乳蛋白酶抑制肽的Ｎ－端上，以使所述肽结合到木瓜凝乳蛋白酶分子 的活性位点上；ｂ）用适宜的洗脱液洗脱木瓜凝乳蛋白酶；Ｂ．１、在ｐＨ值低于２．０的条件下沉淀一种含有粗制木瓜凝乳蛋白酶的水溶液混合物；２、从所述混合物中分离粗制的木瓜蛋白酶的水溶液；３、中和并任选地对所述粗制木瓜凝乳蛋白酶 的溶液进行脱盐；Ｃ．ｉ）酸沉淀一种含有粗制木瓜凝乳蛋白酶的水溶液混合物；ｉｉ）从所述混合物中分离粗制木瓜凝乳蛋白酶的水溶液；ｉｉｉ）中和并任选地对所述粗制木瓜凝乳蛋白酶进行脱盐；ｉｖ）和一种直接亲合色谱基质的活性位点保温 由ｉｉｉ）步骤得到的溶液，该色谱基质含有一种载体基质，该基质，可任选地通过间隔段，共价偶合到一种可逆的木瓜凝乳蛋白酶抑制肽的Ｎ－端，以使所述肽结合到木瓜凝乳蛋白酶分子的活性位点上。ｖ）用适宜的洗脱液洗脱木瓜凝乳蛋白酶。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿伦约翰巴列特，戴维约翰巴特尔，丹尼尔胡伯特里奇，
申请(专利权)人：布茨公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]