木瓜蛋白酶血型诊断试剂的生产方法技术

本发明专利技术阐述了一种用亚热带木瓜的胶乳制作血型及交叉配血诊断试剂的方法，其工艺步骤包括酸沉淀，碱中和，层析和纯化、洗脱、超滤和冷冻干燥，用本方法制得的血液制剂成本低，杂质少，得率高，酶的比活率高，符合医药品质要求。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于血型及交叉配血的诊断试剂，用于Rh、Kidd等血型系统体外免疫学实验，特别是用亚热带作物木瓜的天然胶乳制备血型及交叉配血诊断试剂的方法。木瓜蛋白酶自1947年开始作为一种血型免疫学反应的实验方法，其主要的作用机理为木瓜蛋白酶是一种纯天然植物含巯基(-SH)肽链内切酶，该酶具有蛋白酶和脂酶的活性、有较广泛的特异性，对动、植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，并特别具备可把水解蛋白再重复合成类蛋白的功能，为其他酶种不能比拟。应用木瓜蛋白酶的水解作用对红细胞膜蛋白抗原进行限制性修饰，可使Rh、Kidd等血型抗原充分暴露，从而实现抗原——抗体免疫反应，可用于献血者，受血者、妊娠者、新生儿溶血病等方面的Rh(D)型血型抗原的表型诊断，抗体的分类诊断。国际血液标准化委员会(ICSH)，国际血液学会(ISBT)，美国食品与药物管理局(FDA)于1994年联合召集了国际二十二家实验室曾对木瓜蛋白酶在血液免疫学上的反应进行大规模工作，通过总结认证了木瓜蛋白酶对Rh(D)血型系统免疫凝集反应，在最佳酶活力范围内、最佳操作方法的条件下，是最灵敏的实验诊断方法，其实验的结果优于低离子强度法，与抗人球蛋白法诊断结果并列一致，且费用低于上述两法，操作方便。为此国际组织的有关单位统一了木瓜蛋白酶作为血型试剂的标准化内容，认为有必要生产一种专门供血液免疫学实验使用的木瓜蛋白酶制剂，以保证实验结果的真实性。目前国外基础医学研究发达国家，对Rh血型系统的免疫学诊断方法，已通过医疗行政部门进行立法，成为医疗机构、血液中心的常规检验项目，我国《中国输血技术操作规程》-97版，《全国临床检验操作规程》-97版，已将木板蛋白酶法作为Rh血型系统免疫学检测的首选方法。卫生部在三甲医院的验收标准中也把采用酶法开展血型免疫学实验作为三甲医院输血科，血库验收内容之一。一般人群的血型在以ABO主要血型分类情况下，大多数人同时并存着Rh血型抗原或Rh血型抗体，在我国据1985年以前的调查，汉族人群中Rh抗原阳性者占99.6％，少数民族Rh抗原阳性者占95％，汉族人群不完全性抗体的检出频率为0.3-2.0％，少数民族不完全性抗体的检出频率显著高于汉族。由于医疗、婚姻、生育、人口流动近期人群不完全性抗体的检出率将大有上升。而医学上的常规血型实验或交叉配血实验，只能诊断由完全性抗体所导致的血疫免疫学凝集反应，以区分ABO血型及其相溶性，而对于由不完全性抗体所导致的Rh血型免疫凝集反应只能通过木瓜蛋白酶等试剂于37℃条件下进行实验方可得到诊断结果。由于Rh血型系统与ABO血型系统在临床医学上具有同等重要地位，因Rh血型系统免疫反应可导致受血者死亡，终身残疾，死胎、新生儿溶血症等医疗事故的发生。由此可见，应用木瓜蛋白酶这种无毒无害纯天然试剂，安全可靠、实验精确，意义重大。番木瓜(cayica papava)是一种热带、亚热带植物，它对自然环境、气候、土壤有一定要求，全世界主要有东南亚、南美等少部分地区种植，我国也只有两广，海南，云南，福建，贵州，台湾等几个省区可以种植，但历来木瓜种植主要是采收果实作为水果或蔬菜食用，近年来也开始利用木瓜果实或茎杆采收的胶乳制作化工产品和生物制品，木瓜胶乳中的主要有效成分木瓜蛋白酶(papaia)，木瓜凝乳蛋白酶(chymapapain)，木瓜肽酶(papaya pept-dasa)等，均有不同程度的水解能力，但从木瓜胶乳中提取血型诊断木瓜蛋白酶还在探索阶段，国外一般采用酸洗后用特殊试剂净化，分离杂质，但特殊试剂仍在保密，国内也有一些单位进行了试生产，但其制作成本高、提纯难度大，价格昂贵，用途也未能有较多的开拓，因此木瓜蛋白酶生化产品尚有不少为国内空白。本专利技术的目的是提供一种提取过程简单，收率高，杂质含量少，成本低，能用于Rh血型系统诊断的高纯度，高比活力的木瓜蛋白酶的提取方法。用于提取木瓜蛋白酶的原料来源于以下几方面，1.从鲜木瓜或茎杆中采收获取的鲜胶乳。2.木瓜胶乳的风干物或干燥物。3.经其他初步物理加工的木瓜胶乳制品。本专利技术用于血液制剂的木瓜蛋白酶由于用作医药试剂，制备过程必需严格控制，在除去内部的杂质同时也应避免其他化学物质掺入造成污染和破坏其性质，以下简述生产的工艺步骤一、酸沉淀去杂由于木瓜天然采收回的胶乳含有较多的杂质，而且有一些不需要的化学成分并存，需要在精制前将这些杂质去除，除去的方法是把收采回的胶乳用去离子水以1∶3稀释，通过过滤或离心去除树叶和泥沙。然后加入无机酸如盐酸、硫酸、磷酸等稀液，把PH调至1-3，放置，使胶乳中的杂质在酸性条件下沉淀出来，在酸沉淀过程中，工作时应在4℃温度下进行，边加酸边搅匀，使酸均匀散布于胶乳中，以免因温度变化太大而影响酶活力造成损失，沉淀物通过过滤或离心除去。二、碱中和经酸沉淀的滤液，由于溶液呈酸性，要进行中和，中和剂使用无机碱，特别在NaOH、KOH、Ca(OH)2中选取，将溶液PH至中性，PH7左右，经半透膜渗析脱盐。三、去除重金属经酸碱液处理过的木瓜胶乳，还可能存在着痕量的重金属元素，为了得到高纯度的产品，可将上述溶液加进还原剂如二硫苏糖醇活化，并加入螯合剂如EDFA，用量1-2/‰，使溶液中的铜、铜、铁、镉等重金属去除，通过渗析分离，但大多数木瓜种植地含重金属元素极微，一般情况下可视原料测检情况而决定取舍这一步骤。四、层析和纯化为了提高木瓜蛋白酶的纯度和试剂的性能，需对其进行层析和纯化，层析是采用添加中性盐进行，将上述得到的木瓜胶乳以体积计算，加进硫酸铵粉末，使浓度达40-50％，放置0.5-1小时，让木瓜蛋白酶结晶沉淀，离心或压滤分离。把沉淀物用少量去离子水溶解，放进0.01M醋酸-醋酸钠缓冲液中PH5.0，装进经同等缓冲液充分平衡过的CMC-纤维素离子柱，酶溶液约等于离子柱三倍量，进行离子吸附，让带正电荷的木瓜蛋白酶基因结合在CMC-纤维素载体上，从而得到进一步层析纯化。五、洗脱洗脱过程是通过洗脱液将木瓜蛋白酶从上述CMC-纤维素载体有选择性地解吸置换出来，以获得目标产品最好的有效成份，本专利技术常用的洗脱剂为0.01M醋酸、醋酸钠缓冲液PH5.0洗脱，把醋酸缓冲溶液以一定流速加进离子柱，收集蛋白峰，直到流出液蛋白成分最少为止。六、超滤分离浓缩从洗脱液中回收的木瓜蛋白酶，可应用超滤膜处理，通过超滤膜的分子筛分离技术，将纯化后的木瓜蛋白酶中的细菌、病毒、胶乳固体中微粒及水份去除，超滤过程还能使纯化后的木瓜蛋白酶得到浓缩，干燥时间大幅度缩短，降低制造成本和提高产品质量。本专利技术采用截留分子量10000单位的中空纤维超滤膜，截留率可达93％，这种超滤膜条件温和，无相变化，不易引起物质破坏，能使木瓜蛋白酶的大分子物质截留下来，而水及小分子杂质能透过滤膜，从而达到浓缩和纯化的目的。在超滤过程中，可采用絮凝技术和超滤技术相结合，可使提取收率提高和缩短时间。絮凝法是将一定量的洗脱后的木瓜蛋白酶液在不断搅拌下，慢慢加入一定量的多糖絮凝剂，再依次加入无机助凝剂调节PH后，搅拌均匀后静置沉淀，离心过滤，测定上清液的透光度和酶活，所述的多糖类絮凝剂为无毒性的fc-1，添加量0.2g/L、PH5.0-5.5，无机絮凝助凝剂为fc-2加量0.2g/LPH5.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用木瓜胶乳生产血型诊断试剂的方法，其特征在于其工艺步骤为：（１）用去离子水冲稀或溶解木瓜胶乳，加入无机酸使杂质沉淀分离；（２）加入氢氧化钠或氢氧化钾、氢氧化钙中和，并用半透膜渗析脱盐；（３）去除痕量重金属；（４）层析和纯化；（５）木瓜蛋白酶的洗脱；（６）用超滤膜超滤；（７）低温真空升华干燥；（８）加隋性气体或氮气密封保存。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋开泉，
申请(专利权)人：宋开泉，
类型：发明
国别省市：45[中国|广西]