桄榔植物蛋白酶的提取方法技术

本发明专利技术涉及一种植物中提取的新蛋白酶种及其提取方法。采用砂糖椰子植物作原料，用无机盐沉淀法提取粗酶。经离子交换法提取精酶。所提取的桄榔植物蛋白酶具有耐Ｎａ↓［２］Ｓ↓［４］Ｏ↓［６］、ＤＦＰ、ＰＭＳＦ、乙醇和高ｐＨ的特性。（*该技术在2011年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从植物中提取的新蛋白酶种及其提取方法。酶是生物催化剂。根据酶的来源，可分为动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶三类。植物蛋白酶由于资源丰富，不需要采用象微生物发酵培养之类的复杂工艺，因而受到重视。植物蛋白酶是植物组织中含有的天然物质。可以应用到食品、制革、洗涤及医药工业之类的许多领域。植物蛋白酶常常按习惯以植物“属”命名。已经提取形成生产的植物蛋白酶有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、剑麻蛋白酶等。众所周知，不同的植物蛋白酶，具有不同的性质。因而开发新的植物蛋白酶种，就可以扩大用途。如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和剑麻蛋白酶活性最适PH范围在中性，三种酶室温下在50%乙醇中失活。本专利技术的目的在于采用非常规的植物蛋白酶提取方法，提取新的，具有耐乙醇和高PH值的植物蛋白酶。本专利技术采用无机盐沉淀法(提取粗酶)和高PH去杂离子交换法(提取精酶)从棕榈科(Palmaceae)桄榔属(Areaga)砂糖椰子(Areaga Pinnata、又名桄榔)植物中提取桄榔蛋白酶的工艺过程顺序包括采用砂糖椰子做原料→榨取汁液→硫酸铵去除杂蛋白、沉淀→干燥为粗酶 (透析)/() 用碱调PH9.5左右沉降→DE52层析→冷冻干燥为精酶制剂。本专利技术工艺过程所采用的砂糖椰子植物包括其茎、果柄、果皮和果肉。但以果肉的含酶量最高。在成熟度不同的果实中，又以果实充分长大，但又未成熟变软时的酶得率最多且活性最高。本专利技术工艺过程用硫酸铵去除杂蛋白和沉淀时，先用25～35%饱和度硫酸铵加入榨取的桄榔汁液中去除杂蛋白，然后上清补足50%饱和硫酸铵取其沉淀。本专利技术工艺过程采用碱调节PH时。所用的碱可是氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化铵、铵水。但最好是用氢氧化钠将经透析的粗酶调PH至9.5左右。本专利技术工艺过程所采用DE52层析。也可用CM52、22、QAE25、50等柱取代进行分离，但分离效果不如DE52。本专利技术经DE52柱层析酶能分离9个在280nm处有吸收的蛋白峰，其中2、4、5峰有活性。第5蛋白峰为主要活性成份。经等电聚焦鉴定DE52柱层析成份5。证实DE52层析的酶制剂较纯，等电点在PH3.99左右。将对应等电为PH3.99的位置上切下的胶体进入系统测活，显示该蛋白带有活性，证明该蛋白带确是蛋白酶。用SPS电泳证明酶的分子量为4.4万道尔顿。采用本专利技术方法所得到的桄榔蛋白酶，除具有一般的巯基蛋白酶性质外，还表现出以下特性(1)桄榔蛋白酶比菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶的巯基试剂耐受力要高出两个数量级。5×10-3mol的Na2S4O6和10-3mol的DFP、PMSF对它的活性无影响;(2)桄榔蛋白酶极耐碱，在PH9.6-11之间有最高活性，PH13时酶活性还有PH7时的1/3;(3)桄榔蛋白酶在50～75%的乙醇(30分钟)内都显示出几乎最高活性。桄榔蛋白酶的以上特性，显示了它在生物工程中作为工具的前景。实施例1剥取充分长大的桄榔果实的果肉100克压榨得57ml汁液，边搅拌边加入60ml40%饱和度的硫酸铵溶液。静置12小时后离心(4000转/分)取出上清液，在搅拌下加放固体硫酸铵，使溶液达50%硫酸铵饱和度。静置12小时，离心(10000转/分)取沉淀。加PH9.3的NaOH溶液溶解沉淀，试液用透析膜透析除盐。再用NaOH调已透析后的试液为PH9.3，离心(10000转/分)，取上清液用DE52柱层析分离。取层析成分5冷冻干燥成精酶0.37克、活力485万紫外单位/克。实施例2柱层析前的操作同实施例1。取上清液用CM52柱层析分离，取层析成分1，冰冷干燥成精酶0.52克、活力为293万紫外单位/克。实施例3制备过程按实施例1。将冷冻干燥改成50℃热风干燥，得精酶0.35克，活力为308万紫外单位/克。实施例4-7取砂糖椰子的茎、果实柄、果皮、果肉各1000克，分别榨取汁液，用酪蛋白法直接测汁液活性，结果见表1。表1 实施例8-10将不同成熟度砂糖椰子果实采收后洗净剥取果肉。各称取1000克，分别榨取汁液后照实施例1提取粗酶方法，按所得汁液比例加入硫酸铵提取粗酶，并用酪蛋白法测定各自活性。结果见表2。表2 实施例11-14桄榔酶与现有技术木瓜酶对乙醇耐受性的比较。将本专利技术实施例1所得到的精酶用不同浓度的乙醇配制成酶液(1∶10000)。并以木瓜酶作对照40℃预热15分钟后进入测定系统(用酪蛋白法测定蛋白酶水解活性)。表3列出了桄榔酶对不同浓度乙醇在不同作用时间下的耐受性。表权利要求1.一种植物蛋白酶。其特征在于从砂糖椰子(ArengaPinnata)提取的桄榔蛋白酶有耐碱、耐乙醇、耐Na2S4S6以及二异丙基氟磷酸(DFP)和苯甲基磺酰氟(PMSF)的特性。2.按权利要求1所述的桄榔植物蛋白酶，其特征在于它在PH9.5-11之间有最高活性，PH13时活性还有PH7时的1/3。3.按权利要求1所述的桄榔植物蛋白酶，其特征在于它在75%浓度以内的乙醇中保持原有的活性。4.按权利要求1所述的桄榔植物蛋白酶，其特征在于5×10-3mol的Na2S4O6对它无影响。5.按权利要求1所述的桄榔植物蛋白酶，其特征在于10-3mol的DFP、PMSF对它无影响。6.提取桄榔植物蛋白酶的方法，其特征在于采用砂糖椰子植物作原料，按下列步骤进行砂糖椰子植物→榨汁→沉淀去杂→干燥 (透析)/() 用碱调PH沉降→层析→干燥→成品。7.按权利要求6所述的提取步骤，其特征在于是采用砂糖椰子的茎、果柄、果皮和果肉作原料，最好是用果肉。8.按权利要求6、7所述的提取步骤，其特征在于所用的是已充分长大，但又未成熟变软的果实的果肉。9.按权利要求6所述的提取步骤，其特征在于用25～35%饱和度硫酸铵加入汁液去杂，然后上清补足约50%饱和硫酸铵取沉淀。10.按权利要求6所述的提取步骤，其特征在于用氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化铵、铵水调PH至9.5左右沉降。11.按权利要求6所述的提取步骤，其特征在于用DE52柱层析分离效果最好。全文摘要本专利技术涉及一种从植物中提取的新蛋白酶种及其提取方法。采用砂糖椰子植物作原料，用无机盐沉淀法提取粗酶。经离子交换法提取精酶。所提取的桄榔植物蛋白酶具有耐Na文档编号C12N9/50GK1066468SQ91103150公开日1992年11月25日 申请日期1991年5月9日 优先权日1991年5月9日专利技术者叶启腾, 陈强, 李春香 申请人:广西亚热带作物研究所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物蛋白酶。其特征在于从砂糖椰子（ＡｒｅｎｇａＰｉｎｎａｔａ）提取的桄榔蛋白酶有耐碱、耐乙醇、耐Ｎａ↓［２］Ｓ↓［４］Ｓ↓［６］以及二异丙基氟磷酸（ＤＦＰ）和苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）的特性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶启腾，陈强，李春香，
申请(专利权)人：广西亚热带作物研究所，
类型：发明
国别省市：45[中国|广西]