本发明专利技术涉及人生长抑素受体２亚型与大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体及其建立与应用。利用内部核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）串联ＳＳＴＲ－２与ＣＤ，使两者同步表达，建立新的报告基因系统；利用生长抑素受体介导的抑制肿瘤增殖作用、放射性杀伤和显像作用及ＣＤ的“自杀”效应，联合杀伤肿瘤。三者有机的结合起来，相互促进，起到单一治疗不可达到的效果，为“自杀”基因联合放射性免疫杀伤和显像治疗肿瘤提供一种新途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
的分子克隆和基因治疗，具体涉及构建人生长抑素受体2亚型与大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体及其建立和应用，利用“自杀”基因结合放射性显像和内照射等多重作用杀伤肿瘤细胞。
技术介绍
肿瘤是当今社会威胁人类健康的最严重的疾病之一，临床上常规多通过手术、放疗、化疗等方法进行治疗，但在大多数情况下，这些治疗方法不能从根本上治愈病痛，而且毒副作用大，因此疗效不尽如人意。基因治疗的出现给人们带来了新的希望，所谓基因治疗，就是将某种核酸物质(基因表达载体或其他)转移到患者体内，实现特定基因的表达，或封闭特定基因的功能，以达到治疗疾病目的的一种技术。它在治疗肿瘤、病毒性疾病(如乙肝、HIV感染等)和一些遗传、代谢类疾病等的尝试中都取得了令人鼓舞的成效，显示出良好的应用前景。截至2003年12月，世界各国共批准基因治疗临床方案636项，涉及病人3496人，其中60％以上是针对肿瘤的。目前用于肿瘤基因治疗的基因包括细胞因子基因，肿瘤抑制基因，“自杀”基因，以及外源毒素基因等。其中，包括胞嘧啶脱氨酶(CD)基因在内的“自杀”基因是少数在临床上被证实具有确凿疗效的基因。美国食品与药品管理局(FDA)批准了多项关于“自杀”基因的临床治疗方案，但是单一“自杀”基因治疗的效果尚不令人满意。生长抑素受体(Somatostatin Receptor，SSTR)是一种G蛋白偶联的膜受体，分布在下丘脑、脑垂体，以及胃肠道、胰腺、胆囊、肾上腺、及甲状腺等部位。SSTR在大多数生长抑素起源的肿瘤中都有高密度的表达，如垂体腺瘤、胰岛细胞瘤、类癌瘤、嗜铬细胞瘤及小细胞肺癌等，另外在乳腺、肾、结肠的腺癌，以及脑膜瘤、高分化星形细胞瘤及淋巴瘤中已有一定的表达。SSTR存在五种不同的分子亚型SSTR1，SSTR2，SSTR3，SSTR4，SSTR5。20世纪90年代初五种亚型的SSTR分子被相继克隆出来。在同一种类的肿瘤中还存在SSTR亚型表达的差异。如在肺癌中小细胞肺癌中以SSTR2为主，而肺腺癌、肺鳞癌这两种非小细胞肺癌中以SSTR1为主。生长抑素受体能够与生长抑素(Somatostatin)及其类似物(Somatostatinanalog，SSA)发生高特异性、高亲和力的结合，通过膜内信号传递机制产生生物活性，生长抑素的生物学活性不仅仅止于它对内外分泌腺的抑制作用，经研究还发现它可以通过多种途径作用于肿瘤，抑制肿瘤生长1.直接抗增殖作用 通过与肿瘤部位的生长抑素受体结合上调腺苷酸环化酶、磷酸蛋白激酶的活性，降低Ca2+浓度，以及抑制磷脂酰肌醇-3-激酶途径抑制促肿瘤细胞增殖的细胞因子和分子信号，并促进肿瘤细胞发生凋亡。2.间接抗增殖作用 通过抑制促肿瘤生长的激素和生长因子如生长激素(GH)、表皮生长因子(EGF)等以及抑制血管内皮生长因子(VEGF)的促血管形成作用，抑制肿瘤的生长、修复、浸润、和血行性转移。自上世纪80年代以来，人们开始进行SSTR肿瘤显像以及放射性靶向性治疗研究，即应用放射性核素标记SST或SSA，识别和结合SSTR阳性的肿瘤细胞，进行肿瘤的显像诊断和放射性靶向治疗，并可作为报告基因跟踪目的基因的表达，这些研究均取得了理想的结果。1994年，FDA通过临床应用111In-Octeotide进行全身显像，目前又通过了99mTc标记配基可用于肺癌显像。在SSTR家族成员中，SSTR2由于与多种配基结合时具有较高的亲和力和特异性，因此应用最为广泛。但是其应用范围限于SSTR2阳性的肿瘤细胞，并不是在所有人类肿瘤中都表达SSTR2基因，这样，SSA对SSTR2基因阴性的肿瘤不能起到抑肿瘤作用和靶向性放疗作用。胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)是一种转换药物前体的“自杀”基因，其表达产物可以将无毒性的药物前体5-FC(5-fluorocytosine，5-氟胞嘧啶)，转变为细胞毒性化疗药物5-FU(5-fluorouracil，5-氟尿嘧啶)。其优势是人体可以耐受大剂量的5-FC而不产生明显的毒副作用，在肿瘤局部产生高浓度的杀伤作用，同时引发较强的“旁观者效应”-CD基因阴性靶细胞由于邻近细胞带有药物转变基因也被杀伤。但是单一的基因治疗目前看来难以起到满意的临床治疗效果，而且在实验中难于定位治疗转基因、难于监控疗效等问题，都限制了研究的进展。我们需要一种能够良好监控目的基因转移、表达的方法。
技术实现思路
本专利技术通过建立“自杀”基因-胞嘧啶脱氨酶(CD)与报告基因-人生长抑素受体(SSTR)2的共表达载体，利用“自杀”基因/前体药物系统，并协同SSTR2靶向的放射性显像和内照射杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。人生长抑素受体2亚型与大肠肝菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体，其具有序列表<400>1的序列。上述载体构建方法按以下步骤进行 (1)RT-PCR克隆人SSTR2基因培养含人SSTR2基因的细胞，待细胞生长至足够数量时，提取细胞总RNA，反转录成cDNA第一链，以str5和str3为引物，PCR扩增人SSTR2 cDNA，PCR产物经电泳回收后，用EcoR I和NotI酶切，克隆入pcDNA3载体的相应位点，得到pcDNA3-SSTR2，并进行序列测定。RT-PCR所用引物如下str55’-ttt gaattc atg gac atg gcg gat gag cca ctc aat gga-3’；str35’-ttt gcg gcc gctcag ata ctg gtt tgg agg tct cca t-3’。(2)基因拼接与载体构建以pIRES2-EGFP载体为模板，用引物ir5和si3进行PCR，获得3’端带有SSTR2部分序列的IRES核苷酸序列，同时以pcDNA3-SSTR2为模板，用引物ist5和str3进行PCR，获得5’端带有IRES部分序列的SSTR2核苷酸序列；上述两次PCR产物混合作为模板，以ir5和str3为引物进行PCR，获得IRES-SSTR2序列串联体，并经测序证实；该串联体用BamHI/NotI酶切后，克隆入同酶切割的pIRES2-EGFP-CD，以取代其中的IRES-EGFP序列，得到pIRES-SSTR2；进一步以EcoRI和SmaI酶切pAd-CD载体，得到CD基因，并克隆入pIRES-SSTR2相应位点，最终获得CD和SSTR2双顺反子表达载体pCD-IRES-SSTR2(pCIS)；相关引物序列如下ir55’-tca agc ttc gaa ttc tgc agt cga cgg tac-3’；si35’-cgc cat gtc cat ggt tgt ggc cat att atc atc-3’ist55’-atg gcc aca acc atg gac atg gcg gat gag cca-3’。共表达载体在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。本专利技术将“自杀”基因CD和报告基因SSTR2通过IRES连接，内部核糖体进入位点(IRES)可以将2个基因串联起来，在同一启动子作用下使2个基因转录产生一条双顺反子mRNA，后者在翻译时，核糖体分别识别5’端的翻译起始位点和位于2个基因编码序列之间的IRES，独立地翻译产生2本文档来自技高网...
【技术保护点】
人生长抑素受体２亚型与大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体，其具有序列表〈４００〉１的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汪静，贾林涛，王喆，李国权，
申请(专利权)人：汪静，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]
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