表皮干细胞构建组织工程化角膜上皮植片的制备方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种用表皮干细胞构建的人工角膜上皮植片的制备及用于移植修复因角膜缘干细胞缺损而失明的眼表的用途。表皮干细胞构建的人工角膜上皮植片，无菌采取成人颈部或关中奶山羊耳缘皮肤，用组块培养法和克隆筛选法分离纯化表皮干细胞，用无血清培养基进行扩增，并对所获干细胞进行ＣＫ↓［１９］、Ｐ６３、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－β↓［１］等表皮干细胞的标志蛋白免疫组织化学检测；再将纯化的表皮干细胞接种在去上皮细胞的人类羊膜支架上，无血清培养基培养，培养２１天后，表皮干细胞在羊膜上分化形成复层，成为表皮干细胞羊膜植片；经透射电镜观察，表皮干细胞分为５－６层细胞；具有正常角膜上皮相似结构。以羊为实验动物模型进行自体或同种异体表皮干细胞羊膜植片移植均取得良好效果。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种表皮干细胞构建的人工角膜上皮植片的制备方法，采用来源于成体皮肤组织的表皮干细胞进行制备，其特征在于，包括以下步骤：　　　　１）无菌采取０．５×０．６ｃｍ↑［２］大小的成人颈部皮肤或哺乳动物（主要包括宠物，家畜和珍稀野生动物）耳缘皮肤，用组织块培养法和克隆筛选法分离纯化表皮干细胞，用无血清培养基进行扩增，并对所获得干细胞进行ＣＫ↓［１９］、Ｐ６３、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－β↓［１］等表皮干细胞的标志蛋白免疫组织化学检测，均为阳性，证明所使用的细胞具表皮干细胞特征；　　　　２）将３－４代的纯化的表皮干细胞接种在去上皮细胞的人羊膜支架上，用无血清培养基培养，第一周为浸没培养，培养条件：３７℃，５％ＣＯ↓［２］，饱和湿度，每两天换液；第２－３周采用气－液界面培养，培养条件：３７℃，５％ＣＯ↓［２］，饱和湿度，每天换液；培养２１天后，表皮干细胞在羊膜上分化形成复层，即为可用于移植的表皮干细胞羊膜植片；　　　　３）所制作的表皮干细胞羊膜植片经透射电镜观察，表皮干细胞分为５－６层细胞；基底层细胞呈柱状为祖细胞特征，细胞形态正常；细胞间有桥粒结构，细胞与基底膜之间有半桥粒结构，具有正常角膜上皮相似结构。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨学义，屈雷，王馨，窦忠英，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：61[中国|陕西]