本发明专利技术公开了一种抑制猪生长抑素受体2基因表达的siRNA，属于基因工程技术领域。本发明专利技术所述的siRNA正义链具有SEQIDNO:1~3所示的任一序列。本发明专利技术还公开了含有该siRNA的shRNA编码基因及由其构建的慢病毒干扰质粒pshRNA-copGFPLentivector。通过实时定量Real-timePCR检测发现，各siRNA片段能使猪生长抑素受体2mRNA表达量显著降低约70%以上，ELISA检测SSTR2蛋白表达量降低30%以上。本发明专利技术的siRNA片段及其表达载体可用于制备抑制猪生长抑素受体2表达的制剂，能够显著下调SSTR2基因的表达量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学以及生物工程
，具体涉及抑制猪生长抑素受体2 基因表达的siRNA片段。
技术介绍
shRNA 即短发夹 RNA (short hairpin RNA)。在 RNAi 干扰过程中，产生 dsRNA 的一个有效方法就是在体内表达一个短发夹RNA，这种shRNA包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补)，中间由一个loop序列分隔，组成发夹结构。在体内shRNA可以加工成siRNA (small interfering RNAs，siRNA)，从而降解目的基因抑制其表达。RNAi (RNA interference, RNAi)是由双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。因此，RNA技术又被形象地称为基因沉默(gene silencing)。RNA是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(post-transeriptional gene sileneing PTGS)。siRNA是RNAi机制中最重要的发现。生物学研究证实，siRNA为3 ‘端突出 2-3nt，长为19-23 nt的双链RNA，5'端为磷酸基，3'端为羟基，这种结构特点说明dsRNA 被与RNaseIII相似的酶加工过。RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(initiation and effecting steps)。在起始阶段，加入的双链RNA被切割为21-23个核苷酸的小分子干扰 RNA (small interfering RNAs, siRNA) 研究表明Dicer 酶是 RNaseIII 家族中能特异识别双链RNA的一种，它以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的dsRNA，将dsRNA降解为21bp左右的双链RNA，每个片段的3'端都有2 个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上，mRNA与siRNA的反义链结合，置换出正义链，然后RISC上的核酸酶以一定的间隔，在被识别的2个核酸中间进行切割，以核酸内切酶作用方式对mRNA进行核酸内切害Ij，导致mRNA降解。在体外(in vitro)可用不同的方法将siRNA导入靶细胞，一般来讲化学合成和体外酶法合成的siRNA可用电转移、微注射和转染的方法引入细胞。而表达质粒则常通过转染的方法导入靶细胞然后再表达siRNA。向体内(in vivo)导入siRNA的方法，有研究者用静脉注射的方法将合成的siRNA引入动物体内进行基因功能的研究(Elbashir et al.， 2001)，但这些方法所产生的抑制效应都很短暂。如果以病毒为载体则能进一步提高转染效率。以逆转录病毒载体的shRNA在抑制HIV及丙肝病毒等方面的研究，显示了较好的效果。 慢病毒载体是常用的病毒载体之一，其特点为免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相细胞， 能将自身携带片断整合入宿主细胞基因组。目前研究表明慢病毒载体能在哺乳动物各类细胞稳定表达siRNA，长期抑制基因表达。猪的生长速度是在生产中一个很重要的评定指标。动物生长过程受多种激素的调节，其中生长激素(GH)和胰岛素类生长因子(IGFS)是调节动物生长的核心。而GH的释放又主要受正负两种因子调控，其中正性调控因子生长激素释放因子(Growth Hormone Releasing Factor, GRF) XW^^MM^MMM (Growth Hormone Releasing Hormone, GHRH)是存在于人和动物体内的一种生物活性物质，主要由下丘脑合成并分泌，能特异诱导生长激素的合成与分泌；负调控因子生长激素释放抑制因子(Somatostatin，SST)又称生长抑素，是抑制动物生长的主要因素，是一种抑制脑垂体分泌生长激素的神经调节肽，广泛分布于脊椎动物中枢和外周神经系统，胰腺和胃肠道等组织的一类结构相关肽，以14肽为主，包括28肽、12肽及SST原等多种形式。SST与GRF —起，调节人和动物体内生长激素的浓度。SST多种生物学作用的发挥，是通过应答细胞膜上高特异性、高亲和力的SST受体 (SSTRs)而介导的。SSTR基因中存在着5种不同的亚型，即SSTRU SSTR2、SSTR3、SSTR4、 SSTR5。不同亚型的SSTRs主要分布于脑、胰腺、垂体等多种组织中，其各自的功能也有差别。SSTR2在脑组织、甲状腺、胃肠、肝、胰等均有不同程度的表达，通过shRNA技术抑制 SSTR2的表达，SSTR2蛋白表达量下降，SST与SSTR的结合下降，间接促进GH的释放，达到促进动物的生长。SiRNA作为一种新的基因干预工具，具有高效、特异、快速等优点，国际上大量研究表明基因表达干预效果优于反义技术，更具有应用价值。但是对于猪生长抑素受体基因的 siRNA还未见研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中还没有对猪生长抑素基因进行控制的产品这一缺陷，提供一种猪生长抑素受体2 (简称SSTR2)基因表达的siRNA。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的一种抑制猪生长抑素受体2 (简称SSTR2)基因表达的siRNA，分别命名为SSTR2-1、 SSTR2-2和SSTR2-3，其核苷酸双链中正义链序列如下 SSTR2-1 SEQ ID N0:1 ； SSTR2-2 SEQ ID N0:2 ； SSTR2-3 SEQ ID N0:3。所述SiRNA与SSTR2基因mRNA反向互补，其长度为19 27bp。含有上述siRNA 的 shRNA。上述shRNA的编码基因，两端带有汉3 H I和I酶切位点的序列，便于构建表达质粒，双链核苷酸序列如下SSTR2-ldsDNA:正义链具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列；SSTR2-2dsDNA 正义链具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列；SSTR2-3dsDNA 正义链具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。一种表达载体，由上述shRNA的编码基因与出发载体构建的，即将shRNA编码基因插入出发载体上构建而成。病毒载体可以直接高效率地感染细胞，且转染效果更佳稳定，作为上述出发载体中的优选方案，其中病毒载体最优选pshRNA-copGFP Lentivector0该载体具有完整的 shRNA插入位点以及GFP报告基因，实现了靶基因shRNA的高效表达、病毒包装以及转基因的直观展示。本专利技术的SiRNA可以制备成基因药物或其他合适的制剂用于抑制猪生长抑素受体2的表达，从而提高猪的生长性能，促进其生长。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果本专利技术的siRNA沉默效果好，能够下调SSTR2基因的表达。通过实时定量Real-time PCR检测发现各干扰片段能使SSTR2 mRNA表达量显著降本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种抑制猪生长抑素受体２基因表达的ｓｉＲＮＡ，其特征在于，所述ｓｉＲＮＡ的正义链具有以下任一序列：ＳＳＴＲ２－１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１；ＳＳＴＲ２－２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２；ＳＳＴＲ２－３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３。
【技术特征摘要】
1.一种抑制猪生长抑素受体2基因表达的siRNA，其特征在于，所述SiRNA的正义链具有以下任一序列SSTR2-1 =SEQ ID N0:1 ； SSTR2-2 :SEQ ID NO:2 ； SSTR2-3 :SEQ ID NO:3。2.—种shRNA，其特征在于含有权利要求1所述的siRNA。3.权利要求2所述shRNA的编码基因，其特征在于是下述任一双链核苷酸序列 SSTR2-ldsDNA 正义链具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列；SSTR2-2dsDN...
【专利技术属性】
技术研发人员：张永亮，杨林，习欠云，林海丹，何玮璇，蔡伟光，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81
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