TC-83衍生的甲病毒属载体、颗粒和方法技术

本公开内容提供了ＴＣ－８３ＶＥＥ－衍生的复制子、甲病毒属复制子颗粒和含有ＴＣ－８３甲病毒属复制子颗粒的免疫原性组合物，它们当被引入合适的宿主细胞时指导至少一种抗原表达。在此描述的ＴＣ－８３ＶＥＥ－衍生的ＡＲＰｓ有所改进，因为它们产生比现有技术的ＡＲＰｓ更低的载体特异性免疫反应。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
本专利技术涉及重组DNA技术，且具体涉及将外来核酸引入真核细胞，且更具体涉及生产对免疫治疗和/或基因治疗应用有用的甲病毒属复制子颗粒的组合物和方法。具体地，本专利技术公开了基于委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)疫苗株TC-83的甲病毒属复制子颗粒系统的遗传背景。甲病毒属是披膜病毒科(Togaviridae)的成员，多种病毒被归入甲病毒属。甲病毒属基因组是单链信使有义RNA，5’末端被甲基化帽修饰和3’末端被可变长度的聚腺苷酸带修饰。含有单个病毒蛋白，壳体的结构亚基与RNA基因组结合在二十面体的核壳中。在病毒粒体中，核壳由覆盖着规律排列的跨膜蛋白突起的脂质被膜围绕，每个突起由两个糖蛋白E1和E2的三个异源二聚体复合物组成。参见Paredes等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 909095-9099。新培斯病毒和塞姆利基森林病毒被认为是原型甲病毒属并已被广泛研究。参见Schlesinger，The Togaviridae and Flaviviridae，PlenumPublishing Corp.，New York(1986)。VEE病毒也已被广泛研究，参见例如美国专利号5,185,440，5,505,947和5,643,736。繁殖缺陷性甲病毒属颗粒，称作甲病毒属复制子颗粒作为病毒载体送递系统已经显示出巨大前景。构建复制子以携带可代替一些或全部甲病毒属结构基因的一个或多个异源抗原。复制子连同表达不是该复制子编码的病毒结构蛋白的辅助构建体一起被引入甲病毒属允许细胞，或做为选择，复制子被引入能够表达该结构蛋白的包装细胞。然后复制子被所表达的结构蛋白包装，类似于完整甲病毒属基因组的包装。接着，将这些包装的复制子或甲病毒属复制子颗粒接种给动物。该颗粒进入宿主细胞，然后复制子从次基因组mRNA以非常高水平表达引入的异源编码序列或其他功能性序列。随后的病毒子代被阻止装配，因为复制子并不编码全部必需的病毒包装(结构)基因。复制子的甲病毒属遗传背景和用于包装复制子的甲病毒属结构蛋白都对复制子颗粒的最终性能具有重要影响。在甲病毒属当中，优选VEE病毒作为疫苗载体，因为它天然嗜淋巴细胞，这在相对低的免疫剂量下引发强烈的细胞和体液免疫反应(Davis，NL等人，(1996)J.Virol.70(6)3781-7；MacDonald，GH和Johnston RE，(2000)J.Virol.74(2)914-922；Caley IJ等人，(1997)J.Virol.713031-3038；Hevey M等人，(1998)Virology 251(1)28-37；Caley IJ等人，(1999)Vaccine 1723-24；Pushko，P等人，(2001)Vaccine 19142-153)。已知几个委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)株，且在那些株内，已经识别了亚型。已经在新大陆热带和亚热带地区的马科动物蚊媒流行性脑脊髓炎期间分离了有毒力的VEE株。最具毒力的兽疫株之一Trinidad驴(TRD)株，其属于IA/B亚型，在组织培养中连续传代以产生称为TC-83的活减毒株(Berge等人，(1961)Amer.J.Hyg.73209-218)。这个株在大多数人和马中可诱导产生VEE特异性中和抗体并已在两个物种中成功用作疫苗(McKinney等人，(1972)“Inactivated and live VEE vaccines-A Review，in VenezuelanEncephalitis，pp.369-376，Sc.Pub.No.243 Pan American HealthOrganization，Washington，D.C.；Walton TE等人，(1972)Am.J.Epidemiol 95247-254；Pittman PR等人，(1996)Vaccine 14(4)337-343)。尽管如此，这个疫苗在安全和功效方面仍存在几个问题。首先，在人疫苗中它可以引起不利的，有时是中等严重的反应。其次，TC-83株显示出残留的鼠毒性且在脑内(i.c.)或皮下(s.c.)接种后对乳鼠是致死的(Ludwig G等人，(2001)Am.J.Trop.Med.Hyg.Jan-Feb；64(1-2)49-55)。第三，TC-83株在人中具有相当大的无反应者百分比，即接种后不显示出明显体液反应的个体(Pittman PR等人，(1996)Vaccine 14(4)337-343)。最后，已知与亲本TRD株或VEE的其他兽疫株相比，TC-83株对干扰素特别敏感(Spotts，DR等人，(1998)J.Virol.7210286-10291)。这种对干扰素增加的敏感性将引导人们料想复制子颗粒中的异源基因在感染细胞中表达效率较低和/或这种颗粒在体内免疫原性将较低。所有这些与VEE的TC-83疫苗株有关的有害因素已引导以前的研究者寻求更好的减毒株以用作有繁殖能力的VEE载体或用在复制子颗粒系统中(例如Davis NL等人，(1994)Arch.Virol.Suppl.999-109；Davis NL等人，(1996)J.Virol.70(6)3781；Pushko等人，(1997)同前；Pratt WD等人，(2003)Vaccine 21(25-26)3854-3862)。继续需要最优化突变和甲病毒属株的组合以提供用于疫苗和/或基因治疗应用的最有效甲病毒属复制子颗粒。专利技术概述本专利技术提供了有传染性、复制缺陷性、高免疫原性的基于具体甲病毒属株即VEE的TC-83的甲病毒属复制子颗粒组合物及其制备方法。如前所述(参见例如美国专利号5,792,462；6,156,558；5,811,407；6,008,035；6,583,121；WO 03/023026；美国公开号2003/0119182，全部在此引入作为参考)，已由几个不同的甲病毒属及其嵌合体制成了功能性的甲病毒属复制子颗粒(例如参见美国公开号2003/0148262)。这些颗粒对疫苗和基因治疗应用有用，且在这些应用中甲病毒属复制子颗粒的最佳特性不同。例如，它可能用于降低基因治疗应用过程中从复制子表达蛋白，且因此本域已经开发了技术来降低这种表(参见例如美国专利号5,843,723和6,451,592)。在疫苗应用的情况下，最大化从复制子表达异源RNA，最小化任何抗载体反应，和靶向免疫系统的组织和细胞是需要的特征。已证明甲病毒属委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒和南非虫媒病毒86号在疫苗应用中特别有用。为提高这些甲病毒属载体在产生可复制病毒的罕见事件中的安全性，在甲病毒属基因组片段中引入至少一个减毒突变。本专利技术人现已发现VEE的TC-83株可以用作甲病毒属复制子颗粒系统的遗传背景，其提供了用于免疫原性组合物的惊人有效的VEE颗粒制剂且它具有对疫苗载体系统有用的其他惊人有利性能，包括轻易制备纯化制剂的能力。本专利技术人已发现VEE的TC-83株是衍生得到复制子疫苗颗粒的好得出奇的甲病毒属株。TC-83序列的全序列已公开(Kinney RM等人，(1989)Virology 17019-30；且在Kinney RM等人，(1993)J.Virol.67(3)1269-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备ＴＣ－８３衍生的甲病毒属复制子颗粒（ＡＲＰｓ）的方法，所述方法包括步骤：　　　　（ａ）将ＴＣ－８３－衍生的甲病毒属复制子核酸引入宿主细胞，所述复制子核酸包含至少病毒包装信号和至少一个可在所述甲病毒属复制子核酸中表达的异源编码序列或功能性序列，其中所述宿主细胞包括至少一种辅助功能，以产生修饰的宿主细胞；　　　　（ｂ）在允许至少一种辅助功能表达的条件下培养所述修饰的宿主细胞，从而允许所述ＴＣ－８３－衍生的甲病毒属复制子核酸复制和将所述甲病毒属复制子核酸包装以形成ＡＲＰｓ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：JO雷纳，JF史密斯，B哈比，EA里普，
申请(专利权)人：阿尔法瓦克斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]