本发明专利技术公开了一种黄樟素氧化物作为诱导凋亡的工具在血管内皮细胞与神经干细胞培养体系中的应用。其中：所述黄樟素氧化物以浓度为７０ｍｇ／Ｌ的量处理血管内皮细胞与神经干细胞的共培养体系，黄樟素氧化物表现为诱导血管内皮细胞凋亡，进而由凋亡的血管内皮细胞又诱导体系中的神经干细胞凋亡及ＤＮＡ片段化。本发明专利技术以建立的内皮细胞与神经干细胞的共培养体系来模拟体内的微环境，以黄樟素氧化物作为诱导凋亡的工具，研究了培养体系中血管内皮细胞与神经干细胞的变化，开拓黄樟素氧化物的新用途，同时为研究体内血管内皮细胞维持神经干细胞存活及分化的机制提供方法，为今后治疗各种由于神经细胞缺失造成的神经退型性疾病提供实验基础和理论依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及黄樟素氧化物的用途，尤其涉及黄樟素氧化物作为诱导凋亡的工具，在血管内皮细胞与神经干细胞培养体系中的应用。
技术介绍
黄樟素氧化物结构式为 分子式C10H10O3分子量178，性状浅黄色液体，沸点b.p.118℃/4mmHg，折光率n201.533。黄樟素氧化物在40多年前已被合成出来。关于其应用的报道，始见于20世纪70年代，其用途多是将该化合物作为底物用于氧化物水解酶的光谱分析；20世纪80年代又发现黄樟素(微弱的致癌剂)在动物体内代谢时产生黄樟素氧化物。1995和1996年乔特(Qato)和根斯那(Guenthner)对黄樟素氧化物与DNA的结合性进行了研究(见《Toxicol Lett》1995，75(1-3)201-207和《Drug Metab Dispos》1996，24(9)1020-7)，发现该化合物在体外能与DNA结合，并通过与DNA中的脱氧鸟核苷酸结合形成加合物，但在动物体内未检测到黄樟素氧化物与肝脏DNA之间该加合物的形成，进一步的研究证明黄樟素氧化物与DNA的结合为共价结合，除主要与鸟核苷酸结合外，它也能与DNA的其它3种碱基结合，其机制与黄樟素氧化物含有具生理活性的甲撑二氧苯基与环氧结构有关。申请人已经发现，浓度为5～25mg/L的黄樟素氧化物能促进血管内皮细胞铺展和生长，而浓度为50～100mg/L的黄樟素氧化物则促进血管内皮细胞的脱壁和DNA片段化，最终诱导血管内皮细胞凋亡(见《Acta Pharmacologica Sinica》2002，23(4)323-326和专利号为ZL 02110135.3的《黄樟素氧化物在血管内皮细胞生长与凋亡中的应用》专利)。在机体内，神经干细胞并不是随意分布的，而是集中在血管附近，这就使神经干细胞与血管内皮细胞在空间上紧密相连，加强了两种细胞间的信息传递，形成了血管内皮细胞与神经干细胞组成的微环境，内皮细胞通过向微环境中释放各种细胞因子来维持神经干细胞的存活与分化。为了更好的研究内皮细胞与神经干细胞之间的相互作用，进而为治疗各种神经系统退型性疾病提供理论依据，在体外，人们通常以建立内皮细胞与神经干细胞的共培养体系来模拟体内的微环境。与神经干细胞共培养的内皮细胞，可以维持神经干细胞存活并且诱导其分化，但是凋亡的内皮细胞对神经干细胞有何作用？经权威机构检索查新，目前国内外尚未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是以黄樟素氧化物作为诱导凋亡的工具影响血管内皮细胞与神经干细胞培养体系，研究黄樟素氧化物的影响作用以及培养体系中血管内皮细胞与神经干细胞的变化，开拓黄樟素氧化物的新用途。本专利技术所述黄樟素氧化物作为诱导凋亡的工具在血管内皮细胞与神经干细胞培养体系中的应用。其中以浓度为70mg/L的黄樟素氧化物处理血管内皮细胞与神经干细胞的共培养体系，黄樟素氧化物表现为诱导血管内皮细胞凋亡，进而由黄樟素氧化物引起凋亡的血管内皮细胞又诱导在共培养体系中的神经干细胞凋亡及DNA片段化。为了更好地理解本专利技术的实质，下面用黄樟素氧化物的药理实验及结果来说明其作为诱导凋亡的工具，在凋亡的血管内皮细胞与神经干细胞培养体系中的应用。黄樟素氧化物的制备将70％的间氯过氧化苯甲酸(27克，0.11摩尔)溶解在500毫升氯仿或苯中，加入黄樟素(黄樟素与间氯过氧化苯甲酸的摩尔比为1∶1.0～1∶1.5)，在0-50℃搅拌2-24小时，用5％～9％碱液洗涤三次后，再水洗三次，用无水硫酸镁干燥，过滤后减压浓缩，剩余物进行减压蒸馏或用硅胶柱层析分离(展开剂为石油醚/乙酸乙酯＝1∶1～3∶1，体积比)，得到纯黄樟素氧化物，并经核磁共振及红外光谱验证后备用。其化学合成反应式如下 血管内皮细胞的制备以常规方法培养人脐静脉血管内皮细胞，选取生长状态良好的、且处于对数生长期的血管内皮细胞备用。神经干细胞的制备以常规方法提取培养小鼠神经干细胞，同样选取生长状态良好的，提取后6天的神经干细胞备用。采用细胞生物学和分子生物学的方法，进行如下实验研究黄樟素氧化物作为诱导凋亡的工具，在凋亡的血管内皮细胞与神经干细胞培养体系中的应用。1、黄樟素氧化物对血管内皮细胞的作用将血管内皮细胞接种于24孔板中，经黄樟素氧化物处理24小时后，光镜及荧光显微镜下直接观察血管内皮细胞形态变化。结果表明浓度为50～100mg/L的黄樟素氧化物促进血管内皮细胞脱壁和DNA片段化，最终诱导血管内皮细胞凋亡，其最适作用浓度为70mg/L(见《Acta Pharmacologica Sinica》2002，23(4)323-326)(见附图1)。2、黄樟素氧化物对神经干细胞的作用(1)用MTT法检测神经干细胞琥珀酸脱氢酶的活性，以判断神经干细胞生长情况将神经干细胞接种子96孔培养板中，经黄樟素氧化物处理后加入5mg/ml的MTT溶液0.02ml，37℃孵箱内培养4小时，加入0.2ml三连液，37℃孵箱内培养5小时，振荡15分钟，用酶联免疫检测仪测定光密度(OD值)，计算细胞相对存活率表明处理组细胞存活率较正常对照组没有明显变化(见附图2)。结果说明浓度为10-100mg/L的黄樟素氧化物处理神经干细胞72小时，对神经干细胞存活没有影响，不能诱导神经干细胞死亡，细胞存活率无明显变化。(2)倒置相差显微镜观察神经干细胞形态学变化以诱导血管内皮细胞凋亡用的最适作用浓度为70mg/L的黄樟素氧化物，处理神经干细胞72小时后，光镜下直接观察神经干细胞的形态学变化。结果表明神经干细胞形态没有发生明显变化，仍呈现克隆球状悬浮于培养液中(见附图3)。以上实验说明，浓度为10-100mg/L黄樟素氧化物不能抑制小鼠神经干细胞生长，不诱导其凋亡。3、黄樟素氧化物对血管内皮细胞与神经干细胞共培养体系的作用(1)倒置相差显微镜观察血管内皮细胞与神经干细胞共培养体系中细胞形态学变化将神经干细胞与血管内皮细胞共培养3天后，光镜下直接观察，悬浮的神经干细胞全部贴于血管内皮细胞上，并且伸出细胞突触呈现神经元及神经胶质细胞状，克隆球与克隆球之间通过神经细胞突触形成网络状连接(见附图4)。(2)神经细胞特异性标记物鉴定分化的神经干细胞激光共聚焦电子扫描显微镜观察与血管内皮细胞共培养后的神经干细胞，神经元特异性标记物NSE、NF-L及突触素呈现阳性；星形胶质细胞特异性标记物GFAP呈现阳性(见附图5)。结果表明共培养体系中，血管内皮细胞诱导神经干细胞分化为神经元及胶质细胞。(3)黄樟素氧化物处理血管内皮细胞与神经干细胞的共培养体系将血管内皮细胞接种于24孔培养板中，培养两天后，将神经干细胞直接接种于血管内皮细胞上，以诱导血管内皮细胞凋亡用的最适作用浓度为70mg/L的黄樟素氧化物处理共培养体系。5小时后，倒置相差显微镜下观察到少量的神经干细胞伸出突触，开始分化；10小时后，血管内皮细胞凋亡，同时，已分化的神经细胞突触断裂消失，克隆球出现弥散状，克隆球的紧密结构解体，神经干细胞凋亡(见附图6)。(4)荧光显微镜观察细胞核凝缩及核碎裂情况将血管内皮细胞与神经干细胞共培养，同时加入70mg/L黄樟素氧化物处理10小时，进行AO染色。血管内皮细胞大量凋亡，细胞核DNA发生大量的凝缩及碎裂。在荧光显微镜下选取神经干细胞所在的焦平本文档来自技高网...
【技术保护点】
黄樟素氧化物作为诱导凋亡的工具在血管内皮细胞与神经干细胞培养体系中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苗俊英，赵宝祥，张尚立，苏乐，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]
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