一种增加单核细胞贴壁数量的方法，其特征是先将ｐＨ值为７．５－１０．０的细胞培养液加入细胞培养瓶或细胞培养板中，浸泡细胞培养瓶或细胞培养板的底部５－３０分钟，再将制备好的细胞混悬液加入到细胞培养瓶或细胞培养板中，使每毫升液体中单核细胞总数在１×１０↑［７］－２×１０↑［８］之间，然后在ＣＯ↓［２］培养箱中培养５－３０分钟，取出后轻轻晃动细胞培养瓶或细胞培养板，在倒置显微镜下观察单核细胞贴壁的数量，贴壁细胞较少时，再放到ＣＯ↓［２］培养箱中培养１０－２０分钟。本发明专利技术操作简单，缩短了单核细胞贴壁所需要的时间，获得大量能分化成树突状细胞的单核细胞，提高了树突状细胞制备的数量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种培养细胞的方法，特别是涉及一种在树突状细胞制备过程中增加单核细胞的贴壁数量和贴壁能力的方法。
技术介绍
树突状细胞(DC)是针对晚期恶性肿瘤的治疗而开发出的一种治疗肿瘤疫苗。树突状细胞(DC)是体内最强的抗原递呈细胞，是机体免疫的始作俑者，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。树突状细胞作为瘤苗能有效地打破机体对肿瘤的耐受，激活T淋巴细胞，杀伤并清除肿瘤细胞。在治疗肿瘤方面，DC既可用于独立的治疗方法，治疗对化疗和放疗不敏感的病人，降低死亡率；又可用于辅助治疗方法，防止手术后癌细胞的转移和复发。已报导的临床观察资料表明，上述疗法的疗效超过以往所报道的各种生物疗法，被认为是最具希望的抗肿瘤治疗方法，具有广泛的临床应用前景。单核细胞是制备树突状细胞的主要细胞，在树突状细胞制备的过程中，根据单核细胞可以粘附于细胞培养板或细胞培养瓶底部的特性，将单核细胞和淋巴细胞、粒细胞分离开来，将贴壁的单核细胞进一步培养，促使其分化为树突状细胞。因此单核细胞贴壁的数量决定了树突状细胞制备的数量；增加单核细胞贴壁的数量，可以提高树突状细胞的临床治疗效果。目前基本采用细胞培养液和细胞制成混悬液直接加入到细胞培养瓶或细胞培养板中，
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，用它制备树突状细胞的数量能提高2-6倍，促使单核细胞贴壁的时间减少到1/4-1/8，提高了树突状细胞的产量，缩短了操作时间。，其特征是先将PH值为7.5-10.0的细胞培养液加入细胞培养瓶或细胞培养板中，浸泡细胞培养瓶或细胞培养板的底部5-30分钟，再将制备好的细胞混悬液加入到细胞培养瓶或细胞培养板中，使每毫升液体中单核细胞总数在1×107-2×108之间，然后在CO2培养箱中培养5-30分钟，取出后轻轻晃动细胞培养瓶或细胞培养板，在倒置显微镜下观察单核细胞贴壁的数量，贴壁细胞较少时，再放到CO2培养箱中培养10-20分钟。本专利技术操作简单，缩短了单核细胞贴壁所需要的时间，获得大量能分化成树突状细胞的单核细胞，提高了树突状细胞制备的数量，为提高树突状细胞抗肿瘤临床治疗效果和大规模临床应用提供了支持。具体实施例方式按本专利技术的方法，先将PH值为7.5-10.0的细胞培养液加入细胞培养瓶或细胞培养板中，浸泡细胞培养瓶或细胞培养板的底部(贴壁细胞粘附面)5-30分钟，再将制备好的细胞混悬液加入到细胞培养瓶或细胞培养板中，使每毫升液体中单核细胞总数在1×107-2×108之间，然后在CO2培养箱中培养5-30分钟，取出后轻轻晃动细胞培养瓶或细胞培养板，在倒置显微镜下观察单核细胞贴壁的数量，如果贴壁细胞较少，再放到CO2培养箱中培养10-20分钟。吸出未贴壁细胞(悬浮细胞)，向贴壁细胞加入树突状细胞培养液，使这些贴壁细胞分化成树突状细胞。实施例1李某某，男，47岁。患胃腺癌手术后，为防止肿瘤复发，做树突状细胞抗肿瘤治疗。用血细胞分离机采集病人外周血单个核细胞，将核细胞平均分为2份，一份按照本专利技术方法操作将PH值为8.0的有RPMI 1640细胞培养液30ML加入底面积为175CM2的细胞培养瓶中，浸泡细胞培养瓶底部30分钟，将制备好的单个核细胞混悬液加入到细胞培养瓶中，使最终浓度达到每毫升液体中的细胞数为1×108，加入葡萄糖酸钙，使葡萄糖酸钙在液体中的重量百分浓度为0.1％，在CO2培养箱中培养30分钟，取出后轻轻晃动细胞培养瓶，在倒置显微镜下观察，细胞贴壁数量很多，将贴壁细胞做树突状细胞培养。另一份按照现有方法操作。结果表明，现有方法获得的树突状细胞数为3.1×107，而本专利技术的方法获得的树突状细胞数为14.9×107，是现有方法的4.8倍。实施例2刘某某，男，65岁。患结肠癌并手术切除，为防止肿瘤复发做树突状细胞抗肿瘤治疗。用血细胞分离机采集病人外周血单个核细胞，将核细胞平均分为2份，一份按照本专利技术方法操作将PH值为8.5的RPMI 1640细胞培养液20ML加入底面积为175CM2的细胞培养瓶中，将细胞培养瓶倾斜，使细胞培养液仅能浸泡细胞培养瓶底部的一半，30分钟后，将制备好的单个核细胞混悬液加入到上述细胞培养瓶中，使最终浓度为每毫升液体中的细胞数为2×107，不加葡萄糖酸钙，在CO2培养箱中培养15分钟，取出后轻轻晃动细胞培养瓶，在倒置显微镜下观察，在高倍镜下计数相同面积的经细胞培养液浸泡的和未经细胞培养液浸泡的细胞贴壁数量。结果表明经细胞培养液浸泡的细胞贴壁数量为528，未经细胞培养液浸泡的细胞贴壁数为235，本专利技术是现有方法获得细胞贴壁数的2.24倍。实施例3李某某，女，67岁。手术切除卵巢癌后复发，经放疗治疗无效，而做树突状细胞抗肿瘤治疗。用血细胞分离机采集病人外周血单个核细胞，将核细胞平均分为2份，一份按照本专利技术方法操作将PH值为10的RPMI 1640细胞培养液20ML加入面积为175CM2的细胞培养板中，浸泡细胞培养板10分钟，除去细胞培养液，将制备好的细胞浓度为每毫升8×107单个核细胞的混悬液加入到细胞培养板中，加入葡萄糖酸钙，使葡萄糖酸钙在液体中的重量百分浓度为0.2％，在CO2培养箱中培养20分钟，取出后轻轻晃动细胞培养板，在倒置显微镜下观察细胞贴壁的数量，将贴壁细胞做树突状细胞培养。另一份按照现有方法操作。结果显示，现有方法获得的树突状细胞为5.1×107，而本专利技术的方法获得树突状细胞为28.2×107，是原方法的5.5倍。本专利技术用碱性细胞培养液浸泡细胞培养瓶或细胞培养板，使细胞培养瓶或细胞培养板带有一定量的负电荷，这些负电荷促使单核细胞贴附在培养瓶或细胞培养板的底面，加入少量的钙离子，有助于单核细胞的贴附。用本专利技术方法对数十例肿瘤病人进行树突状细胞抗肿瘤治疗效果表明，由于本专利技术所获得的树突状细胞多，所以临床效果远好于现有方法。权利要求1.，其特征是先将PH值为7.5-10.0的细胞培养液加入细胞培养瓶或细胞培养板中，浸泡细胞培养瓶或细胞培养板的底部5-30分钟，再将制备好的细胞和培养液的混悬液加入到细胞培养瓶或细胞培养板中，使每毫升液体中单核细胞总数在1×107-2×108之间，然后在CO2培养箱中培养5-30分钟，取出后轻轻晃动细胞培养瓶或细胞培养板，在倒置显微镜下观察单核细胞贴壁的数量，贴壁细胞较少时，再放到CO2培养箱中培养10-20分钟。2.如权利要求1所述的，其特征是所述的在CO2培养箱中培养之前，加入葡萄糖酸钙，使葡萄糖酸钙在液体中的重量百分浓度为0.01-0.2％。全文摘要，其特征是先将pH值为7.5－10.0的细胞培养液加入细胞培养瓶或细胞培养板中，浸泡细胞培养瓶或细胞培养板的底部5－30分钟，再将制备好的细胞混悬液加入到细胞培养瓶或细胞培养板中，使每毫升液体中单核细胞总数在1×10文档编号C12N5/06GK1986778SQ20061007079公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月13日 优先权日2006年12月13日专利技术者高岱清, 魏仁敏, 刘瑞贞, 张建军, 牛爱荣, 刘淑贞, 刘新伟 申请人:青岛市中心医院本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种增加单核细胞贴壁数量的方法，其特征是先将ＰＨ值为７．５－１０．０的细胞培养液加入细胞培养瓶或细胞培养板中，浸泡细胞培养瓶或细胞培养板的底部５－３０分钟，再将制备好的细胞和培养液的混悬液加入到细胞培养瓶或细胞培养板中，使每毫升液体中单核细胞总数在１×１０↑［７］－２×１０↑［８］之间，然后在ＣＯ↓［２］培养箱中培养５－３０分钟，取出后轻轻晃动细胞培养瓶或细胞培养板，在倒置显微镜下观察单核细胞贴壁的数量，贴壁细胞较少时，再放到ＣＯ↓［２］培养箱中培养１０－２０分钟。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高岱清，魏仁敏，刘瑞贞，张建军，牛爱荣，刘淑贞，刘新伟，
申请(专利权)人：青岛市中心医院，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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