一种分离和培养人脂肪干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种分离和培养人脂肪干细胞的方法，包括：(1)采用由胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ和ACCUTASE组成的混合消化酶溶液消化脂肪抽吸物，消化结束后中和消化酶，离心、过滤，然后用淋巴细胞分离液进一步去除杂细胞；(2)采用无血清培养基培养脂肪干细胞。本发明专利技术一方面能够快速和有效的从脂肪组织中解离细胞，不但提高了干细胞的产量，缩短了分离细胞的时间，还最大程度的保持了细胞的活性；另一方面培养基成分明确，不含任何外源血清成分，能显著的提高脂肪干细胞的贴壁能力和增殖能力，有利于脂肪干细胞在体外扩增和保持其干性，具有良好的应用前景。

A method for isolation and cultivation of human fat stem cells

The present invention relates to a method of cell culture and human adipose derived stem, a separation includes: (1) by collagenase and collagenase II and ACCUTASE mixed solution of digestive enzymes to digest fat aspirates, after digestion and enzymatic digestion, centrifugation and filtration, and further removal of cells by lymphocyte separation medium (2); using serum-free culture of adipose derived stem cells. One aspect of the invention can be dissociated from adipose tissue cells rapidly and effectively, not only improve the stem cell yield, shorten the separation time of the cell, but also preserves a maximum cell activity; on the other hand, medium composition clear, does not contain any exogenous serum components, can adherence and proliferation significantly the increase of adipose derived stem cells, in favor of adipose derived stem cells in the amplification and keep it dry in vitro, it has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种分离和培养人脂肪干细胞的方法
本专利技术属于细胞分离与培养领域，特别涉及一种分离和培养人脂肪干细胞的方法。
技术介绍
间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs)是干细胞的一个分支，是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，广泛存在于多种组织中，如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织和脂肪组织等。间充质干细胞有三个显著的特点：1.体外的培养的间充质干细胞是贴壁生长的；2.间充质干细胞高表达CD73、CD90和CD105,不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR、CD14、CD19和CD11b等标志物；3.在合适的刺激因素下，间充质干细胞能分化成成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等多种组织的细胞。脂肪间充质干细胞，又叫脂肪干细胞(Adipose-DerivedStemCells,ADSCs)是从脂肪组织分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究证明脂肪干细胞在特定的培养条件下能够分化成脂肪细胞、心肌细胞和神经细胞等多种类型的细胞。脂肪干细胞具有很低的免疫原性，因此移植异体的脂肪干细胞不会引起强烈的免疫排斥，为同种异体移植脂肪干细胞提供了有利条件。脂肪干细胞来源广泛，使用抽脂或者切除脂肪的方法可以获得脂肪组织，使用脂肪干细胞不存在伦理上的问题。脂肪干细胞在体外有很强的扩增能力，可以通过体外培养的方法得到大量的脂肪干细胞。脂肪干细胞在丰胸、除皱等美容和整形等行业有很广泛的应用，而且在医疗领域脂肪干细胞也发挥着越来越多的作用。脂肪干细胞在制备和培养过程中会出现以下问题：1.在分离脂肪干细胞的过程中会混入一些杂细胞，会影响脂肪干细胞的贴壁与生长。2.在分离脂肪干细胞的过程中，如果酶解时间太长，会对脂肪干细胞造成损伤。3.多数科研或医疗机构仍然使用动物血清培养脂肪干细胞，但是不同批次的血清质量差别很大，其成分和功能不能保持一致；而且动物血清含有低水平的抑制细胞生长的物质，以及潜在的病毒和支原体污染。4.脂肪干细胞在培养过程中存在一定程度的分化。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种分离和培养人脂肪干细胞的方法，该方法一方面能够快速和有效的从脂肪组织中解离细胞，不但提高了干细胞的产量，缩短了分离细胞的时间，还最大程度的保持了细胞的活性；另一方面培养基成分明确，不含任何外源血清成分，能显著的提高脂肪干细胞的贴壁能力和增殖能力，有利于脂肪干细胞在体外扩增和保持其干性，具有良好的应用前景。本专利技术的一种分离和培养人脂肪干细胞的方法，包括：(1)采用由胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ和ACCUTASE组成的混合消化酶溶液消化脂肪抽吸物，消化结束后中和消化酶，离心、过滤，然后用淋巴细胞分离液进一步去除杂细胞；(2)采用无血清培养基培养脂肪干细胞，其中，无血清培养基添加以下组分：重组人胰岛素：1～10μg/ml；重组人表皮生长因子：10～50ng/ml；重组人碱性成纤维细胞生长因子：10～50ng/ml；重组人转化生长因子-β：1～50ng/ml；重组人血小板衍生生长因子-BB：10～50ng/ml；氢化可的松：0.5～10μg/ml；维生素C：10～100μg/ml；还原型谷胱甘肽：1～5mM；重组人转铁蛋白：0.5～10μg/ml；乙醇胺：1～10μg/mL；L-谷氨酰胺：1～10mM；辅酶A：1～50μg/ml；重组人凝血酶：1～10U/ml；庆大霉素：1～100μg/ml；亚硒酸钠：1～100ng/ml；生物素：1～50μg/ml。所述步骤(1)中的混合消化酶溶液由0.1％～0.4％(m/v)的胶原酶Ⅰ、0.1％～0.4％(m/v)的胶原酶Ⅱ和1/4～1/2×ACCUTASE(STEMCELLTechnologies)组成。所述步骤(1)中的混合消化酶溶液与脂肪抽吸物的体积比为1:1。所述步骤(1)中的消化温度为37℃，消化时间为半小时之内。所述步骤(1)中的中和消化酶采用等体积的含有10％FBS的培养基。所述步骤(1)中的过滤具体为分别用直径100微米和40微米的过滤网过滤。在所述步骤(2)培养脂肪干细胞之前用1～10μg/mL的重组人纤连蛋白包被培养瓶。所述培养瓶在4℃的条件下包被过夜。所述步骤(2)中的无血清培养基为DMEM-F12。在所述步骤(2)培养脂肪干细胞之后细胞传代过程中使用TrypLETM消化细胞。具体的，首先，用无血清的DMEM-F12培养基配制含有0.3％(m/v)的胶原酶Ⅰ和0.3％(m/v)的胶原酶Ⅱ溶液，再把两种胶原酶溶液的混合液和ACCUTASE(STEMCELLTechnologies)以1:1的体积混合；最终得到的混合消化酶溶液含有0.15％的胶原酶Ⅰ、0.15％的胶原酶Ⅱ以及1/2×ACCUTASE。把用生理盐水洗涤过的脂肪抽吸物和混合消化酶溶液以1:1的体积混合，在37℃的恒温摇床中消化15分钟左右，摇床的转速是100rpm。消化结束后，加入等体积的含有10％FBS的培养基中和消化酶。然后以400g的转速离心十分钟，收集细胞沉淀。用生理盐水重悬细胞，让细胞悬液先后通过直径为100微米和40微米的过滤网，得到单个细胞的悬液。为了进一步去除杂细胞，把细胞悬液加到淋巴细胞分离液上方，以400g的转速离心30分钟，直接收集最上面的液体层和分离液之间的细胞层。用生理盐水洗细胞两次，离心后丢弃上清，用新鲜的培养基重悬细胞，把细胞放入培养瓶培养。培养24小时后，换液，用生理盐水洗去没有贴壁的细胞。在随后的培养过程中根据细胞的实际生长情况换液或者传代。本专利技术提供的脂肪干细胞无血清培养基含有多种生长因子和营养物质，这能促使干细胞在无血清培养条件下正常的生长和代谢：纤连蛋白是一种细胞外基质蛋白，能介导细胞之间、细胞和细胞外基质的粘附。用纤连蛋白包被培养瓶能促使细胞更好的贴壁。本专利技术使用重组人纤连蛋白包被培养瓶。重组人胰岛素可以提高细胞的合成代谢能力，刺激细胞的生长。表皮生长因子是一种具有多种功能的生长因子，对细胞有强烈的促分裂作用。碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β和血小板衍生生长因子-BB都是具有促进细胞增殖和分裂的生长因子，这三种因子的组合已被证明能够显著促进间充质干细胞的增殖和增强干细胞的分化能力。氢化可的松是一种糖皮质激素，具有促进糖原异生和提高蛋白质分解代谢等作用。维生素C是一种抗氧化剂，能保护细胞免受自由基的威胁，而且维生素C还参与细胞的代谢，可以显著的促进各种间充质干细胞的增殖。还原型谷胱甘肽是含有巯基(SH)的三肽类化合物，在人体内具有活化氧化还原系统，激活SH酶、解毒作用等重要生理活性。还原型谷胱甘肽还参与三羧酸循环和糖代谢，起到辅酶的作用。转铁蛋白是细胞中的主要铁传递蛋白，转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性并为细胞代谢提供铁元素。乙醇胺参与磷脂类代谢，是细胞生长必须的营养物质。L-谷氨酰胺是细胞生长的重要能量来源，参与蛋白质和脂类的合成与代谢，还能提高细胞的抗氧化能力。L-谷氨酰胺不够稳定，在配制培养基之前会补加L-谷氨酰胺。辅酶A是机体乙酰化反应的辅酶，在糖、脂类和蛋白质代谢中起着非常重要的作用。凝血酶能促使间充质干细胞分泌纤连蛋白，从而增强间充质干细胞贴壁和促进细胞增殖。庆大霉素是一种广谱的抗生素。亚硒酸钠是细胞生长中的必须微量元素，在细胞代谢中起本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离和培养人脂肪干细胞的方法，包括：(1)采用由胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ和ACCUTASE组成的混合消化酶溶液消化脂肪抽吸物，消化结束后中和消化酶，离心、过滤，然后用淋巴细胞分离液进一步去除杂细胞；(2)采用无血清培养基培养脂肪干细胞，其中，无血清培养基添加以下组分：重组人胰岛素：1～10μg/ml；重组人表皮生长因子：10～50ng/ml；重组人碱性成纤维细胞生长因子：10～50ng/ml；重组人转化生长因子‑β：1～50ng/ml；重组人血小板衍生生长因子‑BB：10～50ng/ml；氢化可的松：0.5～10μg/ml；维生素C：10～100μg/ml；还原型谷胱甘肽：1～5mM；重组人转铁蛋白：0.5～10μg/ml；乙醇胺：1～10μg/mL；L‑谷氨酰胺：1～10mM；辅酶A：1～50μg/ml；重组人凝血酶：1～10U/ml；庆大霉素：1～100μg/ml；亚硒酸钠：1～100ng/ml；生物素：1～50μg/ml。

【技术特征摘要】
1.一种分离和培养人脂肪干细胞的方法，包括：(1)采用由胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ和ACCUTASE组成的混合消化酶溶液消化脂肪抽吸物，消化结束后中和消化酶，离心、过滤，然后用淋巴细胞分离液进一步去除杂细胞；(2)采用无血清培养基培养脂肪干细胞，其中，无血清培养基添加以下组分：重组人胰岛素：1～10μg/ml；重组人表皮生长因子：10～50ng/ml；重组人碱性成纤维细胞生长因子：10～50ng/ml；重组人转化生长因子-β：1～50ng/ml；重组人血小板衍生生长因子-BB：10～50ng/ml；氢化可的松：0.5～10μg/ml；维生素C：10～100μg/ml；还原型谷胱甘肽：1～5mM；重组人转铁蛋白：0.5～10μg/ml；乙醇胺：1～10μg/mL；L-谷氨酰胺：1～10mM；辅酶A：1～50μg/ml；重组人凝血酶：1～10U/ml；庆大霉素：1～100μg/ml；亚硒酸钠：1～100ng/ml；生物素：1～50μg/ml。2.根据权利要求1所述的一种分离和培养人脂肪干细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的混合消化酶溶液由0.1％～0.4％m/v的胶原酶Ⅰ、0.1％～0.4％m/v的胶原酶Ⅱ和1/4～1/2×ACCUTASE组成。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：李新峰，
申请(专利权)人：上海莱馥医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31