一种改善高糖高脂环境下骨骼肌萎缩的CD29制造技术

本发明专利技术公开了一种改善高糖高脂环境下骨骼肌萎缩的CD29

A CD29 to improve skeletal muscle atrophy in high glucose and high fat environment

The invention discloses a CD29 to improve skeletal muscle atrophy in high glucose and high fat environment

【技术实现步骤摘要】
一种改善高糖高脂环境下骨骼肌萎缩的CD29+人脐带源间充质干细胞培养方法
本专利技术涉及间充质干细胞领域，具体是一种改善高糖高脂环境下骨骼肌萎缩的CD29+人脐带源间充质干细胞培养方法。
技术介绍
骨骼肌质量和完整性对于肌肉骨骼系统的正常功能以及有效的营养摄取和储存至关重要。骨骼肌组织是身体最大的代谢活性组织、主要的葡萄糖代谢部位和病理状况下其他器官的燃料储存器。肌肉萎缩不仅伴随许多常见的疾病而产生，例如癌症，肾/心力衰竭，败血症，肌肉遗传疾病和神经退行性疾病等，还发生在健康的个体上，如在腿部骨折的固定，卧床休息期间。成年肌肉质量的主要决定因素是外源必需氨基酸（需要通过膳食蛋白质摄入获得）和运动。缺乏能量摄入，不活动，太空飞行或肢体固定等因素都将导致肌肉横截面积（CSA）的减少，相关的功能丧失和肌肉胰岛素抵抗。更重要的是，肌肉量的丧失与更多疾病的发病率和死亡率相关，特别是在老年人群中，肌肉量的丧失在2型糖尿病患者中形成加速。胰岛素介导的葡萄糖摄取也因肌肉萎缩而减弱。也就是说，肌肉萎缩将导致2型糖尿病胰岛素抵抗（IR）。有研究人员对年轻男性进行了为期1周的睡眠研究，证明肌肉质量减少导致全身胰岛素敏感性降低。然而，IR在驱动肌肉萎缩中的作用尚不清楚。另有研究报告证明，持续性IR患者加速肌肉质量下降，肌肉质量的下降与糖尿病或糖化血红蛋白（HbA1c）的持续时间呈负相关。在3年研究期间，与2期糖尿病患者相比，老年2型糖尿病患者膝关节伸肌强度下降了近50％，这表明老年2型糖尿病患者肌肉力量下降加速。在进一步研究中，有学者报道了患有和不伴有糖尿病的个体之间在行走速度，肌肉力量，力量和肌肉质量等方面的差异是独立于共存的外周运动神经病或外周血管疾病，这表明糖尿病本身对肌肉病变有直接影响。另有证据表明，在2型糖尿病中加速的肌肉损失不受胰岛素治疗的影响，这可能与IR有关。因此，2型糖尿病骨骼肌质量改变的发生不好预测，并且程度不同。几项研究的证据表明，饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸可能起到差异调节骨骼肌质量和功能的作用。例如，C2C12肌管被棕榈酸处理后（循环饱和脂肪酸最丰富）肌管直径减小并且胰岛素信号被抑制。与此相应，据报道肌肉细胞中的棕榈酸酯促进诱导前萎缩基因的表达，如atrogin-1/MAFbx，并伴随其转录调节子FoxO3（叉头蛋白）核定位的增加。相比之下，几个体内研究也报道了不饱和脂肪酸具有预防肌量减少和/或萎缩的作用。例如，研究表明携带结肠腺癌的癌症恶病质动物模型（饮食中补充共轭亚油酸）能够保持腓肠肌的肌量；二十碳五烯酸（EPA）弱化恶病质诱导MAC16肿瘤的小鼠腓肠肌减少蛋白质降解；EPA还预防了在施用弗氏佐剂后大鼠腓肠肌肌量的减少，同时使阿霉素-1/MAFbx和MuRF1基因表达正常化。另外，营养不良的仓鼠喂饲富含PUFAα-亚麻酸（ALA）的饮食后，肌肉形态和功能得到改善，其中包括肌纤维增大。同时，ω-3和ω-6PUFA也被证明可以增加p70S6K1蛋白在Thr389处的磷酸化，表明其在L6肌细胞的肌原性分化过程中活性增加。肌肉重塑发生在整个生命中，触发肌肉重塑的因素非常复杂，所以不同的治疗方案可不同程度的延缓疾病的进程。目前，最先进的治疗方法是使用肌原性干细胞来延缓萎缩并用新的健康和功能性肌肉纤维替代患病肌肉。
技术实现思路
本专利技术提供了一种改善高糖高脂环境下骨骼肌萎缩的CD29+人脐带源间充质干细胞培养方法，以丰富间充质干细胞治疗肌肉萎缩这一治疗方法领域的多样性。本专利技术是按照以下技术方案实施的。一种改善高糖高脂环境下骨骼肌萎缩的CD29+人脐带源间充质干细胞培养方法，包括以下步骤:a.将抗人CD29抗体与多聚赖氨酸混匀，平铺于培养皿；b．用PBS溶液将脐带洗涤至无血迹变白；c.将组织剪成小段，纵向剖开，去除血管和脐带外皮后将华尔通胶剪成小片；d．将小片脐带组织剪碎成泥状后加入0.25%的胶原酶IV,37℃消化2-3小时，加入适量10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液混匀，离心，将下部沉淀细胞加入适量10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液种入上述培养皿中，于5%CO2培养箱内倒置培养；e．弃掉上清液，添加适量10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液，每隔3天换一次液，待融合率达85%以上，进行传代培养。进一步的，所述步骤a中抗人CD29抗体与多聚赖氨酸在4-8℃进行混匀。进一步的，所述步骤d中离心条件为2000g离心10-20分钟。进一步的，所述步骤a中抗人CD29抗体与多聚赖氨酸混合比例为1pg/2ug。本专利技术获得了如下有益效果。本专利技术提供了一种治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩的药物或药物的有效成分的制备方法。本专利技术所述方法制备的CD29+人脐带源间充质干细胞可以明显改善db-/-小鼠的高血脂症、高血糖症并可增加db-/-小鼠比目鱼肌和腓肠肌的肌纤维横断面，增加每条肌管内容和细胞数，从而改善db-/-小鼠的骨骼肌萎缩症状。本专利技术制备方法为后续研究和研制治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩的药物奠定了理论基础和试验依据，具有广阔的应用前景。附图说明图1是本专利技术人脐带间充质干细胞刚刚帖壁时形态图；图2是本专利技术人脐带间充质干细胞帖壁后4h形态图；图3是本专利技术人脐带间充质干细胞扩增培养48h形态图；图4是本专利技术人脐带间充质干细胞表面标志物CD73的表达图；图5是本专利技术人脐带间充质干细胞表面标志物CD90的表达图；图6是本专利技术人脐带间充质干细胞表面标志物CD105的表达图；图7是本专利技术人脐带间充质干细胞表面标志物CD45的表达图；图8是本专利技术人脐带间充质干细胞表面标志物HLA-DR的表达图；图9是本专利技术人脐带间充质干细胞表面标志物CD29的表达图；图10是本专利技术CD29+人脐带间充质干细胞诱导分化成脂图（200X）；图11是本专利技术CD29+人脐带间充质干细胞诱导分化成骨图（400X）；图12是本专利技术CD29+人脐带间充质干细胞诱导分化成软骨图（100X）；图13是本专利技术未移植组DB鼠腓肠肌HE切片图（400X）；图14是本专利技术CD29+人脐带间充质干细胞移植后DB鼠腓肠肌HE切片图（400X）；图15是本专利技术未移植组DB鼠比目鱼肌HE切片图（400X）；图16是本专利技术CD29+人脐带间充质干细胞移植后DB鼠比目鱼肌HE切片图（400X）。具体实施方式以下参照附图及实施例对本专利技术进行进一步的技术说明。实施例1CD29+人脐带源间充质干细胞的分离1.1将2ul抗人CD29抗体（R&DSystems，US）在4℃与多聚赖氨酸(Sigma)1mg混匀，平铺于直径90mm培养皿（上海晶安生物科技有限公司），4℃过夜备用。1.2无菌操作，PBS（Gibco）洗涤脐带至无血迹变白。1.3用眼科剪将组织剪成小段，纵向剖开，去除血管和脐带外皮后将华尔通胶剪成小片。1.4将小片脐带组织放在50ml离心管里剪碎成泥状后加入0.1%的胶原酶IV（Gibco）,37℃消化2小时，加入适量含10%胎牛血清的ɑ-MEM（Gibco）培养液混匀，2000g离心10分钟（L-800R江东仪器，中国），弃掉上清液，将下部沉淀细胞加入适量含10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液后转入上述培养皿中，于5%CO2培养箱内倒置培养。1.52h后弃掉上清液，添加适量含10%胎牛血清的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改善高糖高脂环境下骨骼肌萎缩的CD29

【技术特征摘要】
1.一种改善高糖高脂环境下骨骼肌萎缩的CD29+人脐带源间充质干细胞培养方法，其特征在于：包括以下步骤:a.将抗人CD29抗体与多聚赖氨酸混匀，平铺于培养皿；b．用PBS溶液将脐带洗涤至无血迹变白；c.将组织剪成小段，纵向剖开，去除血管和脐带外皮后将华尔通胶剪成小片；d．将小片脐带组织剪碎成泥状后加入0.25%的胶原酶IV,37℃消化2-3小时，加入适量10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液混匀，离心，将下部沉淀细胞加入适量10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液种入上述培养皿中，于5%CO2培养箱内倒置培养；e．弃掉上清液，添加适量10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐静，
申请(专利权)人：吉林省拓华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22