一种脂肪SVF细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种脂肪SVF细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途，该制备方法包含：步骤S1：在无菌条件下式采集脂肪样本，保存在保存液中，加入洗涤液对脂肪样本进行预处理；步骤S2：将预处理的脂肪样本离心，脂肪组织呈黄色，取出脂肪组织并加入等体积已预热的消化液，密封，在恒温条件下使脂肪组织和消化液混合均匀，消化至无大块组织块或虽有大块组织块但聚集大量脂质，离心；步骤S3：待步骤2离心结束，去除上层脂质，加入洗涤液将沉淀重悬混匀，过滤，再次添加洗涤液，离心，去除上清液，得到脂肪SVF细胞。本发明专利技术制备方法采用的洗涤液和消化液使得制备的脂肪SVF细胞的细胞数、细胞活率及纯度大幅度上升，保证提取的SVF细胞在临床治疗中的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪SVF细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途
本专利技术涉及一种脂肪SVF细胞的制备方法，具体涉及脂肪SVF细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途。
技术介绍
成体干细胞是近来发现的一群存在于人体各组织器官内的具有多项分化潜能的干细胞。研究发现，人源脂肪来源的间充质干细胞（humanAdipose-derivedStemcells，hASCs）作为种子细胞有诸多优点：（1）易于取材（只需通过负压真空抽脂）；（2）具有多方向的分化潜能；（3）脂肪间充质干细胞免疫原性低；（4）具有免疫抑制的调节作用。脂肪SVF（StromalVascularFraction，血管基质部分）细胞是从脂肪组织中分离富集出来的基质细胞群，去除了成熟的脂肪细胞，其中包含多种细胞成分，包括脂肪干细胞、内皮细胞、周细胞、成纤维细胞和少量未去除的成熟脂肪细胞。脂肪SVF细胞中的间充质干细胞在临床多个领域都有巨大的应用潜力。在国内外多年研究中，脂肪SVF细胞已被证实具有结缔组织修复，免疫调节，表皮修复等生理功能。现有技术通常将脂肪组织经胶原酶消化、过滤、离心除去成熟脂肪细胞后得到脂肪SVF细胞。但是，就目前技术而言，对于脂肪SVF细胞临床级应用的提取和制备还存在以下的不足：1、传统胶原酶Ⅰ消化单一，胶原酶使用量多，SVF细胞纯度不高；2、制备最后得到的SVF细胞数得率、细胞纯度及细胞活率不高，不适用于临床，保证不了临床治疗的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种脂肪SVF细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途，该制备方法能够解决现有技术胶原酶使用量大，以及细胞活率低，提取的SVF纯度不高等问题，能够减少胶原酶的使用量并提高细胞活率及SVF纯度，以保证在临床治疗时的应用效果。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种脂肪SVF细胞临床级高效制备方法，该制备方法包含：步骤S1：在无菌条件下式采集脂肪样本，保存在保存液中，加入洗涤液对脂肪样本进行预处理；步骤S2：将预处理的脂肪样本离心，脂肪组织呈黄色，取出脂肪组织并加入等体积已预热的消化液，密封，在恒温条件下使脂肪组织和消化液混合均匀，消化至无大块组织块或虽有大块组织块但聚集大量脂质，离心；步骤S3：待步骤2离心结束，去除上层脂质，加入洗涤液将沉淀重悬混匀，过滤，再次添加洗涤液，离心，去除上清液，得到脂肪SVF细胞。在步骤S1中，所述的洗涤液包含：生理盐水和人血白蛋白。在步骤S2中，所述的消化液包含：人血白蛋白、0.9%生理盐水、氯化镁和混合胶原酶，所述的混合胶原酶的质量：人血白蛋白的体积：0.9%生理盐水的体积为1mg：1mL：15mL。在步骤S1中，所述的保存液包含：氯化钠、青霉素和链霉素。在所述的保存液中，所述的氯化钠采用0.9%生理盐水；所述的青霉素的浓度为100μg/mL；所述的链霉素的浓度为100μg/mL。在步骤S1的洗涤液中，所述的人血白蛋白的质量分数为20%，所述的生理盐水和人血白蛋白的体积比为100:1。在步骤S2的消化液中，所述的人血白蛋白为质量分数为20%的人血白蛋白，所述的氯化钠采用0.9%生理盐水；所述的氯化镁采用氯化镁水溶液，所述的人血白蛋白与氯化镁水溶液的体积比为1：29μL，所述的氯化镁水溶液的浓度为200mg/mL。在步骤S2中，所述的消化液预热的温度为37℃。本专利技术还提供了一种用脂肪SVF细胞制备的药物，该药物包含：脂肪SVF细胞，该脂肪SVF细胞通过如所述的脂肪SVF细胞临床级高效制备方法制备；该药物作为治疗骨关节炎的药物。本专利技术还提供了一种用脂肪SVF细胞制备的药物制剂，该制剂包含：脂肪SVF细胞、生理盐水和白蛋白；所述的脂肪SVF细胞通过如所述的脂肪SVF细胞临床级高效制备方法制备；该药物制剂为治疗骨关节炎的药物制剂。本专利技术还提供了一种脂肪SVF细胞的冻存方法，所述的冻存方法包含：步骤S1’：用临床级DMSO和血清替代物混合配成冻存液；步骤S2’：在脂肪SVF细胞中加入冻存液，充分混匀，加入到冻存管中密封；步骤S3’：将冻存管进行程序降温，转移至-196℃液氮罐中保存。其中，所述的脂肪SVF细胞通过如所述的脂肪SVF细胞临床级高效制备方法制备。在步骤S1’中，所述的临床级DMSO和血清替代物的体积比为1：9。在步骤S2’中，在冻存液中，所述的脂肪SVF细胞的浓度为1×106/mL~5×106/mL。在步骤S3’中，所述的程序降温的降温速度为0.1~99.9℃/min，温度从4℃降温至-80℃。本专利技术的脂肪SVF细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途，解决现有技术胶原酶使用量大，以及细胞活率低，提取的SVF纯度不高等问题，具有以下优点：（1）本专利技术的制备方法使用的消化液中含有氯化镁和白蛋白，氯化镁的使用提高了胶原酶的消化能力，同时也节省了胶原酶的使用体积，同时白蛋白使用防止细胞过度消化；（2）本专利技术的消化液各组分的比例的控制能够使得制备脂肪SVF细胞中使用的胶原酶的较少，提高了制备的脂肪SVF细胞的纯度；（3）本专利技术的洗涤液与常规的单一生理盐水或者PBS不同，本专利技术加入了人血白蛋白，人血白蛋白的使用在离心时候保护了细胞，又能防止细胞的过度消化；（4）本专利技术制备的细胞经冻存复苏后，其细胞增值活性强。附图说明图1为本专利技术采用CCK8法测试的对比例1和实施例1制备的脂肪SVF细胞的活性结果图。图2为本专利技术的方法冻存的细胞复苏后细胞显微图。图3为对比例2的方法冻存的细胞复苏后活性测试结果图。图4为本专利技术实施例1流式细胞检测的DAPI-SSC散点图。图5为本专利技术实施例1流式细胞检测的SSC-FSC散点图。图6为本专利技术实施例1流式细胞检测的分析图。图7为对比例1流式细胞检测的DAPI-SSC散点图。图8为对比例1流式细胞检测的SSC-FSC散点图。图9为对比例1流式细胞检测的分析图。具体实施方式以下结合附图和实施例对本专利技术的技术方案做进一步的说明。一种脂肪SVF细胞临床级高效制备的方法，该制备方法包含：步骤S1：在无菌条件下式采集脂肪样本，加入洗涤液对脂肪样本进行预处理；步骤S2：将预处理的脂肪样本离心，脂肪组织呈黄色，取出脂肪组织并加入等体积已预热的消化液，密封，在恒温条件下使脂肪组织和消化液混合均匀，消化至无大块组织块或虽有大块组织块但聚集大量脂质，离心；步骤S3：待步骤2离心结束，去除上层脂质，加入洗涤液将沉淀重悬混匀，过滤，再次添加洗涤液，离心，去除上清液，得到脂肪SVF细胞。在步骤S1中，洗涤液包含：0.9%生理盐水和人血白蛋白。该洗涤液与常规的单一生理盐水或者PBS不同，本专利技术加入了人血白蛋白，人血白蛋白的使用在离心时候保护了细胞，又能防止细胞的过度消化。在步骤S2中，消化液包含：人血白蛋白、0.9%生理盐水、氯化镁和混合胶原酶。其中，混合胶原酶的质量：人血白蛋白的体积：0.9%生理盐水的体积：氯化镁水溶液的体积为1mg：1mL：15mL：29μL。在步骤S1中，保存液包含：氯化钠、青霉素和链霉素。在保存液中，氯化钠采用生理盐水；青霉素的浓度为100μg/mL；链霉素的浓度为100μg/mL。在步骤S1的洗涤液中，人血白蛋白的质量分数为20%，0.9%生理盐水和人血白蛋白的体积比为100:1。在步骤S2的消化液中，人血白蛋白为质量分数为2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂肪SVF细胞临床级高效制备方法，其特征在于，该制备方法包含：步骤S1：在无菌条件下式采集脂肪样本，保存在保存液中，加入洗涤液对脂肪样本进行预处理；步骤S2：将预处理的脂肪样本离心，脂肪组织呈黄色，取出脂肪组织并加入等体积已预热的消化液，密封，在恒温条件下使脂肪组织和消化液混合均匀，消化至无大块组织块或虽有大块组织块但聚集大量脂质，离心；步骤S3：待步骤2离心结束，去除上层脂质，加入洗涤液将沉淀重悬混匀，过滤，再次添加洗涤液，离心，去除上清液，得到脂肪SVF细胞；在步骤S1中，所述的洗涤液包含：生理盐水和人血白蛋白；在步骤S2中，所述的消化液包含：人血白蛋白、0.9%生理盐水、氯化镁和混合胶原酶，所述的混合胶原酶的质量：人血白蛋白的体积：0.9%生理盐水的体积为1mg：1mL：15mL。

【技术特征摘要】
1.一种脂肪SVF细胞临床级高效制备方法，其特征在于，该制备方法包含：步骤S1：在无菌条件下式采集脂肪样本，保存在保存液中，加入洗涤液对脂肪样本进行预处理；步骤S2：将预处理的脂肪样本离心，脂肪组织呈黄色，取出脂肪组织并加入等体积已预热的消化液，密封，在恒温条件下使脂肪组织和消化液混合均匀，消化至无大块组织块或虽有大块组织块但聚集大量脂质，离心；步骤S3：待步骤2离心结束，去除上层脂质，加入洗涤液将沉淀重悬混匀，过滤，再次添加洗涤液，离心，去除上清液，得到脂肪SVF细胞；在步骤S1中，所述的洗涤液包含：生理盐水和人血白蛋白；在步骤S2中，所述的消化液包含：人血白蛋白、0.9%生理盐水、氯化镁和混合胶原酶，所述的混合胶原酶的质量：人血白蛋白的体积：0.9%生理盐水的体积为1mg：1mL：15mL。2.根据权利要求1所述的脂肪SVF细胞临床级高效制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述的保存液包含：氯化钠、青霉素和链霉素。3.根据权利要求2所述的脂肪SVF细胞临床级高效制备方法，其特征在于，在所述的保存液中，所述的氯化钠采用0.9%生理盐水；所述的青霉素的浓度为100μg/mL；所述的链霉素的浓度为100μg/mL。4.根据权利要求3所述的脂肪SVF细胞临床级高效制备方法，其特征在于，在步骤S1的洗涤液中，所述的人血白蛋白的质量分数为20%，所述的生理盐水和人血白蛋白的体积比为100:1。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的脂肪SVF细胞临床级高效制备方法，其特征在于，在步骤S2的消化液中，所述的人血白蛋白为质量...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文荣，
申请(专利权)人：上海莱馥医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31