一种间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料及其应用，其特征在于：以多孔蚕丝蛋白支架为主体，以生物硅化作用对支架进行有机硅包被，作为人骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化的培养载体，采用人骨髓间充质干细胞为种子细胞，将人骨髓间充质干细胞按一定细胞密度接种到硅包被多孔蚕丝蛋白支架上，并将硅包被多孔蚕丝蛋白支架置于成骨诱导分化微环境中进行培养；该支架材料所建立的三维成骨诱导分化体系，不但可以用于骨组织工程定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，更为高效地获得性状稳定的成骨细胞，而且还可为骨组织工程的研究提供重要的理论指导，进而为临床上骨质疏松、骨损伤等骨科疾病的攻克提供了新思路。

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料及其应用
本专利技术属于生物材料
，具体涉及一种人骨髓间充质干细胞体外培养支架材料，及其应用。
技术介绍
骨髓间充质干细胞因其取材容易、易于体外培养增殖，同时具有良好的成骨、成软骨、成脂肪甚至肌原细胞分化潜能，成为骨组织工程研究领域最重要的种子细胞，具有广泛的应用前景。定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，对骨组织工程的研究提供重要的理论指导，进而为临床上骨质疏松、骨损伤等骨科疾病的攻克提供了新思路。相关诱导BMSCs特异性成骨分化研究也已经取得诸多进展，已成功应用多种支架材料进行成骨诱导分化，但目前可促进成骨分化的高机械强度支架材料多为人工合成材料，其难形成理想的材料-细胞界面，影响种子细胞在材料的黏附、增殖、分化，同时材料的机械强度和降解速度之间的矛盾还无法解决且材料在体内仍有一定的抗原性；而更有利于细胞生长增值的天然支架材料可塑性差、机械强度较弱。因此仍需要更多机械强度合适的天然支架来高效获得性状更为稳定的成骨细胞，这将有利于生物工程获得更多骨组织样结构，并启发其未来在骨缺损替代疗法中的应用。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种能够理想维持人骨髓间充质干细胞生长活性，并显著提高人骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化表型与功能的硅包被多孔蚕丝蛋白支架材料。具体的，所述的间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料，其制备方法包括下述步骤：以多孔蚕丝蛋白支架为主体，以生物硅化作用对支架进行有机硅包被，作为人骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化的培养载体；所述多孔蚕丝蛋白支架的制备方法包括，将蚕茧于0.02M碳酸钠溶液中进行萃取并溶解于9.3M溴化锂溶液中，蒸馏水透析并离心，得到2.5g/mL丝素蛋白溶液。将甘油溶液与上述制备的丝素蛋白溶液以3:7的重量比预混合。将所得混合物倒入不锈钢容器中，并冷冻干燥后切片使用。在-40℃下预冷冻6小时冻干36小时后，将所得的支架切成小圆片(3mm直径×1mm厚)，即多孔蚕丝蛋白支架。本专利技术所述的多孔蚕丝蛋白支架的制备方法在下述文献中有所记载MingzhongLi,ShenzhouLu,ZhengyuZu,HaojingYan,JingyuMo,LihongWang.Studyonporoussilkfibroinmaterials:1finestructureoffreeze-driedsilkfibroin.AppliedPolymerScience,2001,79(12):2185-2191。优选的情况下，对于上文所述支架材料的制备方法中，多孔蚕丝蛋白支架置于硅酶(silicatein)溶液中，在2-8℃条件下浸泡6-18h后，将硅酸钠、六氟硅酸钠、四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷按照上述含硅化合物与硅酶质量比5～50:1的比例，加入溶液中，经25-37℃反应1-6h，PBS洗去反应液。上述含硅化合物与硅酶质量比理论上应该是5～100:1都可以的，本专利技术实施例中所用的比例是30:1。优选的情况下，对于上文所述的支架材料的制备方法中，在接种细胞前所述支架材料需经灭菌处理，且浸泡在基础培养基内进行预平衡10-14h。所述灭菌处理方法包括：高温高压灭菌、其他高温方法灭菌或75％乙醇浸泡12-24h。优选的情况下，对于上文所述支架材料的制备方法中，所述间充质干细胞培养方法如下：采用人骨髓间充质干细胞为种子细胞，将人骨髓间充质干细胞以105～106细胞数/支架接种到硅包被多孔蚕丝蛋白支架上，并将硅包被多孔蚕丝蛋白支架置于成骨诱导分化微环境中进行培养。所述的以有机硅包被的多孔蚕丝蛋白支架作为人骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化的培养载体的具体操作步骤如下：将消化的人骨髓间充质干细胞与胶原混合，获得细胞-胶原悬液，然后将细胞-胶原悬液多点接种至多个硅包被多孔蚕丝蛋白支架，并保证人骨髓间充干细胞数量为2～5×105细胞数/支架，胶原的体积为5～15μL/支架。对于上文所述支架材料的制备方法中，所述的将硅包被多孔蚕丝蛋白支架置于成骨诱导分化微环境中进行培养的具体操作步骤如下：将接种完成的硅包被多孔蚕丝蛋白支架按照1个支架/孔的密度放置到多孔细胞培养板中，并将多孔细胞培养板置于细胞培养箱中，在37℃、5％CO2的条件下凝胶化20min，然后向多孔细胞培养板的每个孔中加入成骨诱导培养基，所述的成骨诱导培养基由高糖基础培养基(DMEM)、10％胎牛血清(FBS)、1％双抗(Pen/Strep)、100nM地塞米松(Dexamethasone)、10μMβ-磷酸甘油(β-Glycerolphosphate)、0.5μM抗坏血酸(L-Ascorbicacidphosphate)混合而成。本专利技术同现有技术相比，具有如下优点：本专利技术所公开的人骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导支架材料，该支架材料通过对多孔蚕丝蛋白表面进行生物硅化修饰，其中，多孔蚕丝蛋白支架所特有的生物相容性、机械强度特征及生物降解特性，使得该培养体系易于实现成骨细胞体内移植，这不但可推进骨损伤愈合治疗，而且还可能为探讨有关体外诱导成骨细胞移植的相关研究提供理想的研究模型体系；利用有机硅与细胞之间复杂的相互作用，促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。采用硅包被多孔蚕丝蛋白作为培养支架，同时添加胶原作为培养基质，构建出一个复合培养体系，该复合培养体系不但能够为人骨髓间充质干细胞提供三维生长空间，而且其具有生物相容性、材料可塑性和支持人骨髓间充质干细胞生长的特点，此外，其多孔特征也可大大提高培养体系内的物质传递，从而有利于人骨髓间充质干细胞在体外培养过程中维持其活性及多能性。本支架材料所建立的模型内，细胞间彼此建立细胞通讯，有明显钙盐沉积且可形成类钙结节结构，说明所构建的人骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化体系有利于提高成骨诱导分化表型及功能；该方法所建立的成骨诱导分化体系中，人骨髓间充质干细胞的钙盐沉积、类钙结节形成及成骨特异性基因及蛋白表达均显著高于平面诱导组及无硅包被多孔蚕丝蛋白诱导组成骨细胞的功能活性。附图说明图1为硅包被多孔蚕丝蛋白支架的扫描电镜图(A：多孔丝蛋白；B：硅包被多孔丝蛋白)。图2为利用活/死细胞双染色试剂盒显示人骨髓间充质干细胞在硅包被多孔蚕丝蛋白支架上的生长形态和细胞活性。其中，图中标记D的为极少量显示红色荧光的死细胞，图中未做标记的其余细胞为活细胞，显示绿色荧光。图3为HE染色显示利用本专利技术所述支架材料诱导分化的人骨髓间充干细胞的形态结构。图4为扫描电镜(SEM)检测显示人骨髓间充质干细胞细胞在硅包被多孔蚕丝蛋白支架上的生长形貌及特征(A1-2：多孔丝蛋白诱导组；B1-2：硅包被多孔丝蛋白支架诱导组)。图5为本专利技术所述支架材料诱导分化的人骨髓间充质干细胞的钙盐沉积及类钙结节形成(A：2D硅包被诱导组；B：多孔丝蛋白诱导组；C：硅包被多孔丝蛋白诱导组)。图6为利用qRT-PCR方法检测本专利技术所述支架材料对人骨髓间充质干细胞成骨特异性基因表达水平的影响。图7为本专利技术所述支架材料诱导分化的人骨髓间充质干细胞的成骨特异性蛋白表达图，BMP2：A：2D硅包被诱导组；B：多孔丝蛋白诱导组；C：硅包被多孔丝蛋白诱导组。图8为本专利技术所述支架材料诱导分化的人骨髓间本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料的制备方法，其特征在于：制备方法包括下述步骤：(1)制备多孔蚕丝蛋白支架：将蚕茧于0.02M碳酸钠溶液中进行萃取并溶解于9.3M溴化锂溶液中，蒸馏水透析并离心，得到2.5g/mL丝素蛋白溶液；将甘油溶液与上述制备的丝素蛋白溶液以3:7的重量比预混合；将所得混合物冷冻干燥后切片获得多孔蚕丝蛋白支架；(2)将所述多孔蚕丝蛋白支架置于硅酶溶液中，在2‑8℃条件下浸泡6‑18h后，按照含硅化合物与硅酶质量比5～50:1的比例，加入溶液中，经25‑37℃反应1‑6h，PBS洗去反应液得硅包被多孔蚕丝蛋白支架；其中，所述含硅化合物选自硅酸钠、六氟硅酸钠、四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷。

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料的制备方法，其特征在于：制备方法包括下述步骤：(1)制备多孔蚕丝蛋白支架：将蚕茧于0.02M碳酸钠溶液中进行萃取并溶解于9.3M溴化锂溶液中，蒸馏水透析并离心，得到2.5g/mL丝素蛋白溶液；将甘油溶液与上述制备的丝素蛋白溶液以3:7的重量比预混合；将所得混合物冷冻干燥后切片获得多孔蚕丝蛋白支架；(2)将所述多孔蚕丝蛋白支架置于硅酶溶液中，在2-8℃条件下浸泡6-18h后，按照含硅化合物与硅酶质量比5～50:1的比例，加入溶液中，经25-37℃反应1-6h，PBS洗去反应液得硅包被多孔蚕丝蛋白支架；其中，所述含硅化合物选自硅酸钠、六氟硅酸钠、四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述冻干为在-40℃下预冷冻6小时后，冻干36小时。.3.如权利要求1所述方法制备的支架材料。4.如权利要求3所述的支架材料在间充质干细胞培养方法中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将人骨髓间充质干细胞以105～106细...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秀丽，曹旭鹏，龙灿玲，刘铭，徐红，成旭，
申请(专利权)人：大连医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21