卡介菌多糖核酸在促进CIK细胞增殖和提高CIK细胞的杀瘤活性中的应用制造技术

本发明专利技术涉及卡介菌多糖核酸的用途，卡介菌多糖核酸促进CIK细胞增殖，并提高CIK的杀瘤效果，并在杀瘤效率提高时，相关细胞毒活性因子的表达也增加，通过卡介菌多糖核酸诱导培养的CIK细胞能用于肿瘤疾病的细胞治疗。

【技术实现步骤摘要】
卡介菌多糖核酸在促进CIK细胞增殖和提高CIK细胞的杀瘤活性中的应用
本专利技术属于生物医药和生物治疗领域，具体涉及卡介菌多糖核酸提取物促进CIK细胞增殖和增强CIK细胞杀瘤活性中的应用，以及在制备CIK细胞中的应用。
技术介绍
恶性肿瘤严重危害人类健康，目前常规的手术和放化疗治疗方法均不能彻底清除体内的瘤细胞，过继免疫治疗法因具有符合生理、低毒和高效等优点成为重要的肿瘤辅助治疗手段。其中，细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells。CIK细胞)是近年来发现的一种新型抗瘤细胞，是以CD3+CD56+T细胞为主的异质细胞群，兼有NK细胞和T细胞的特征。在功能上，CIK一方面拥有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，另一方面还拥有NK细胞非MHC限制性的杀伤肿瘤的特点，其增殖迅速、对正常造血影响轻微。CIK细胞的增殖和细胞毒活性依赖于多种外源性细胞因子的刺激，但何种因子组合为最佳尚无定论，因此研究如何进一步提高CIK的增殖和杀瘤活性已经成为抗肿瘤的过继免疫细胞生物治疗的一个热点。
技术实现思路
本专利技术的目的提供卡介菌多糖核酸在促进CIK细胞增殖和提高CIK细胞的杀瘤活性中的应用，技术方案如下：卡介菌多糖核酸在促进CIK细胞增殖和增强CIK细胞杀瘤活性中的应用。卡介菌多糖核酸在制备肿瘤生物治疗细胞中的应用，所述肿瘤生物治疗细胞为CIK细胞。制备CIK细胞的步骤如下：(1)人外周血单核细胞(PBMC)分离①采集健康自愿者血液20mL，平衡温度至室温。同时将淋巴细胞分离液、生理盐水、培养基复温至室温。②样品稀释：取一新的50mL离心管，先加入复温后的生理盐水10mL充分润洗管壁，然后用10mL移液管将血样转移至润洗过的50mL离心管，加生理盐水稀释血样至30mL，用移液管充分吹打均匀。③梯度离心：取另一50ml离心管加入15mL人血淋巴细胞分离液，用10mL移液管将稀释血样缓缓转移至分离液上方，形成上下两相。22℃，390g离心30min(加速1，刹车0)。④收集血浆：离心完成后，离心管内液相分为三层，从下往上分别为分离液、白膜层、血浆层，尽可能收集上层血浆至新的离心管，做好标记，-80度冻存备用。⑤收集白膜层：用10mL移液管或1mL移液器小心收集中间的白膜层至新50mL离心管。⑥清洗Ⅰ：于收集了白膜层的离心管中加RPMI-1640至45mL，混匀，22℃，1000g离心10min(加速9，刹车9)。弃去上清液，加RPMI-1640至45mL重悬，吹打混匀。⑦清洗Ⅱ：22℃，400g离心10min(加速9，刹车9)，弃去上清液，加RPMI-1640至45mL重悬，吹打混匀，取20μL细胞悬液进行台盼蓝染色计数，参照《细胞计数SOP》。⑧清洗Ⅲ：22℃，201g离心10min(加速9，刹车9)。弃去上清液，按细胞数5×106个/mL加GT-T551培养液重悬，吹打混匀。(2)PBMC诱导培养成CIK转移GT-T551培养液重悬的细胞至T25细胞培养瓶，加入终浓度为500ng/mLCD3mAB及1000U/mLIL-2的细胞因子及10％FBS，置于37℃、5％CO2、90％相对湿度的细胞培养箱培养。隔天观察CIK细胞状态，若细胞培养基颜色发黄，适当补液。每3天进行细胞计数，按1.5-2.0×106/mL的细胞密度补加CIK培养液或半量换液。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术中卡介菌多糖核酸促进CIK细胞增殖，增加相关细胞毒活性因子GranzymeB、Perforin、TNF-α、TNF-β、INF-γ、Fas的表达，提高CIK细胞的杀瘤效果；(2)通过卡介菌多糖核酸诱导培养的CIK细胞能用于肿瘤疾病的细胞治疗。附图说明图1：BCG-PSN影响CIK细胞增殖的量效曲线图2：CIK细胞杀伤效率统计图。图3：CIK细胞RNA电泳图。其中Mark为DNAstandardmarker；1为对照组CIK细胞RNA；2为BCG-PSN实验组CIK细胞RNA。图4：RT-qPCR检测CIK细胞毒活性相关因子表达。具体实施方式：本专利技术所述的卡介菌多糖核酸可以为卡介菌多糖核酸原粉(精制的卡介菌多糖核酸提取物)，也可以是卡介菌多糖核酸原粉制得的注射液(按照2010版中国药典第二增补版P400-401记载的制备)，卡介菌多糖核酸原粉可通过按照2010版中国药典第二增补版P400-401记载的制备，也可以通过如下方法获得，但本领域技术人员可以理解卡介菌多糖核酸的制备包括但并不限于此种方法：卡介菌多糖核酸原粉的制备详述如下：1)卡介菌的培养和收获1.菌体培养：将液体低温保藏的菌种(中国卡介苗制备用卡介菌株D2PB302，中国药品生物制品检定所)室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，37℃连续培养14-20天；或在37℃连续培养15天后转种于改良的液体苏通培养基，37℃连续培养14-20天。2.菌体收集：待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，加入适量去离子蒸馏水洗涤，压干后称重。2)卡介菌多糖核酸的制备1.菌体破碎和热酚处理：将收集的菌体按10:1的比例加入纯化水，以组织捣碎匀浆机(12000rpm/min)破碎菌体，3min×3次，将菌体捣碎，然后再加入破碎菌悬液0.5-2.0倍体积量的热苯酚(30～100℃)，在低速搅拌中保温30分钟～1小时。2.卡介菌多糖核酸的提取：将热酚好的混合液自然沉淀1～10天，吸取上清液液，台式离心机高速离心后，取上清液加入等体积酚/氯仿(1:1)，涡旋混匀后13000rpm离心2min，取上清液经0.45μm无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合液。3)精制卡介菌多糖核酸原粉的制备采用美国密里博(MILLIPORE)公司制造的K-PRIME40Ⅱ凝胶层析过滤系统和GH-25凝胶介质进行卡介菌多糖、核酸、苯酚及卡介菌蛋白的分离。具体的制备过程如下：(1)打开主机及监控电脑，将系统预热20至30分钟，并检查管道，柱体是否畅通完好，是否存在气泡。(2)平衡：用0.9％生理盐水以1000mL/分钟经柱正向流动，直至柱前柱后电导、pH一致时结束平衡过程。(3)上样：将卡介菌多糖核酸提取液经上样系统进行上样，上样速度为600mL/分钟。(4)洗脱：上样结束后，用0.9％生理盐水以800mL/分钟速度进行洗脱，采用紫外分光仪(波长采用260nm或280nm)检测流出液，收集目的峰，将收集的核酸目的峰通过0.45μm无菌滤器过滤，即为精制卡介菌多糖核酸提取液。(5)清洗：洗脱后用注射用水对系统进行清洗直至柱前、柱后电导接近于零时为止。将所收集的精制卡介菌多糖核酸提取液进行醇沉，在精制卡介菌多糖核酸提取液中加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为70-75％。自然沉淀4天后，收集沉淀物。沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次，然后用乙醚洗涤离心3次后，放至干燥器干燥，干燥物即为精制卡介菌多糖核酸原粉。实施例11.1材料淋巴细胞分离自健康志愿者外周血。SMMC-7721肝癌细胞系于上海中科院购买，本实验室长期保存。斯奇康卡介菌多糖核酸注射液(1ml/支)为湖南斯奇生物制药有限公司生产。人血液淋巴细胞分离液购自佳和生物。采血针、采血管、生理盐水购自长沙市第四人民医院。人源CD3单抗购自北京同立源生本文档来自技高网...

【技术保护点】
卡介菌多糖核酸在促进CIK细胞增殖和增强CIK细胞杀瘤活性中的应用。

【技术特征摘要】
1.卡介菌多糖核酸在促进CIK细胞增殖和增强CIK细胞杀瘤活性中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于卡介菌多糖核酸在制备肿瘤生物治疗细胞中的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CIK细胞的制备步骤如下：(1)人外周血单核细胞(PBMC)分离①采集健康自愿者血液20mL，平衡温度至室温。同时将淋巴细胞分离液、生理盐水、培养基复温至室温；②样品稀释：取一新的50mL离心管，先加入复温后的生理盐水10mL充分润洗管壁，然后用10mL移液管将血样转移至润洗过的50mL离心管，加生理盐水稀释血样至30mL，用移液管充分吹打均匀；③梯度离心：取另一50ml离心管加入15mL人血淋巴细胞分离液，用10mL移液管将稀释血样缓缓转移至分离液上方，形成上下两相。22℃，390g离心30min(加速1，刹车0)；④收集血浆：离心完成后，离心管内液相分为三层，从下往上分别为分离液、白膜层、血浆层，尽可能收集上层血浆至新的离心管，做好标记，-80℃冻存备用；⑤收集白膜层：用10mL移液管或1mL移液...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡翔，黄招琴，谷陟欣，颜冬兰，朱艳，
申请(专利权)人：湖南斯奇生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43