一种缺氧耐受型间充质干细胞的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种缺氧耐受型间充质干细胞的制备方法及其应用，该缺氧耐受型间充质干细胞来源于人脐带华通氏胶，培养条件为1‑6％的氧气浓度，与富氧条件下培养的间充质干细胞相比，缺氧耐受型间充质干细胞具有更强的旁分泌功能和存活能力；在急性心肌梗死动物模型中，缺氧耐受型间充质干细胞能够有效促进血管新生，并能增强心肌细胞的再生能力；本发明专利技术的缺氧耐受型间充质干细胞制备简易、稳定性高、疗效好，可作为临床治疗急性心肌梗死的优选方案。

Preparation method and application of hypoxia tolerance type mesenchymal stem cell

The invention discloses a hypoxia tolerance type mesenchymal stem cells, preparation method and application thereof, the hypoxia tolerance type of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord Wharton's jelly, cultivation conditions for oxygen concentration 1 6%, and under the condition of oxygen enrichment cultured mesenchymal stem cells in hypoxia tolerance mesenchymal stem cells have a stronger paracrine function and survival ability; in animal models of acute myocardial infarction, hypoxia tolerance of mesenchymal stem cells can effectively promote angiogenesis, and the ability to enhance the regeneration of myocardial cells; hypoxia tolerance of the mesenchymal stem cells, high stability, simple preparation the curative effect is good, can be used as the preferred solution for the clinical treatment of acute myocardial infarction.

【技术实现步骤摘要】
一种缺氧耐受型间充质干细胞的制备方法及其应用
本专利技术涉及干细胞
，具体涉及一种缺氧耐受型间充质干细胞的制备方法及其在治疗急性心肌梗死中的应用。
技术介绍
急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)是一类由于冠状动脉急性闭塞，导致血液供应急剧减少或中断而引起心肌细胞缺血性坏死的疾病，属于心血管疾病中常见的危急重症，因急性心肌梗死而导致的死亡占心血管疾病死亡人数的50％以上。受生活方式、人口老龄化等因素的影响，我国心肌梗死发病率呈明显上升趋势，预估到2030年我国心肌梗死患者数量将达到2300万。目前，临床上治疗急性心梗的方式主要是手术(经皮冠状动脉介入术)和药物(抗血栓药)，这两种方式能够阻止心肌梗死范围的扩大，在一定程度上缓解病情，然而由于成人心肌细胞再生能力很弱，已经发生梗死的心肌不能得到有效修复。通过输注外源性干细胞的方式，能够直接或间接地促进心肌细胞再生，有效修复受损的心肌。干细胞治疗急性心肌梗死受到了越来越多的关注。间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)来源于发育早期的中胚层，是一类具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，广泛存在于机体各个组织和器官中，如新生儿脐带、骨髓、脂肪等；在特定的条件下它能分化成多种组织特异性细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、心肌细胞等。在治疗急性心肌梗死方面，MSCs能够迁移到损伤部位并发生激活，从而旁分泌多种细胞因子，一方面可以激活心肌干细胞，促进其增殖和分化；另一方面还可以促进血管新生，恢复局部供血。虽然MSCs在急性心梗治疗中的安全性及有效性得到了证实，但是干细胞治疗也面临着诸多困难和挑战。MSCs的来源、剂量和输注方式等因素对于治疗效果有很大影响，MSCs在体内的归巢效应和存活时间也直接关系到治疗效果。通过文献检索以及临床试验注册数据统计，可以发现临床研究中所使用的MSCs大多数为自体骨髓来源，而自体骨髓来源MSCs的制备周期至少需要3个星期，这就制约了MSCs在急性心肌梗塞治疗中的应用。此外，体内MSCs所处的微环境是低氧或者缺氧的，特别在骨髓、脂肪等组织中，氧气浓度是极低的(1-8％)。而目前MSCs体外扩增培养的条件是富氧的(O2浓度为21％)，体外培养过程中MSCs所处的微环境与其来源的组织微环境存在较大差异,这样就会导致MSCs的细胞性质、功能发生一定的改变。富氧条件下培养的MSCs输注到心肌梗死部位，这是一个缺氧微环境，对干细胞的活力也会产生负调控作用。本专利技术涉及缺氧耐受型脐带来源间充质干细胞的制备及应用，本专利技术的缺氧耐受型脐带来源间充质干细胞制备简便，易规模化生产，并且经过冻存、复苏处理后能维持较高的稳定性，可以避免因自体来源MSCs的个体化差异导致临床前研究的结果误差。同时，与富氧条件下培养的MSCs相比，缺氧耐受型MSCs具有更强的旁分泌功能和生存能力，能够有效促进血管新生，并能在体内长时间存活。因此本专利技术的缺氧耐受型脐带来源间充质干细胞较好的解决了关于细胞制备周期、存活时间、旁分泌能力等问题，提高了干细胞的稳定性和疗效，开辟了干细胞临床前研究的新领域。
技术实现思路
基于以上背景，本专利技术的目的是提供了一种缺氧耐受型间充质干细胞的制备方法及其应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种缺氧耐受型间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)将脐带剪成1-1.5cm的小段，将脐静脉和脐动脉去除，剥取华通氏胶；(2)将剥好的华通氏胶放入一个盛有PBS的培养皿内清洗，再将华通氏胶剪成1-3mm3大小的组织块，以0.5-1.0cm间距将其接种于培养皿中；(3)室温放置15min后加入10mL完全培养基，放入低氧培养箱内培养，CO2浓度控制为5％，O2浓度控制为1-6％，O2浓度通过N2平衡，温度为37℃；(4)待细胞的融合率达到80％以上时，用胰蛋白酶消化收集细胞，按照5000cells/cm2密度将细胞传代至多个培养瓶中继续培养；(5)传至P3-10代后，用胰蛋白酶消化细胞，300g离心5min进行收集，最后计数并冻存。进一步地，缺氧耐受型间充质干细胞可置于ThermoFisherHeracelTM150i培养箱中，CO2浓度控制为5％，O2浓度控制为1-6％，O2浓度通过N2平衡；而正常型间充质干细胞则置于ThermoForma311培养箱中，CO2浓度控制为5％，O2浓度控制为21％。在本专利技术的实施例2-4中，缺氧耐受型间充质干细胞采用1％氧浓度培养，正常型和缺氧耐受型间充质干细胞采用第4代(P4)细胞。在本专利技术的实施例4中，正常型和缺氧耐受型间充质干细胞移植采用的溶液介质为PBS，细胞密度为1×106cells/mL。本专利技术还提供了该缺氧耐受型间充质干细胞在治疗急性心肌梗死中的应用。本专利技术人创造性的发现，跟现有技术相比，有以下突出的优点：(1)本专利技术的缺氧耐受型间充质干细胞制备简易，并具有很好的稳定性。(2)本专利技术的缺氧耐受型间充质干细胞生存能力强，在缺氧环境下不易凋亡。(3)本专利技术缺氧耐受型间充质干细胞与正常型间充质干细胞相比能释放更多的VEGF和HGF，并能有效促进心肌损伤部位的血管新生。(4)本专利技术的缺氧耐受型间充质干细胞促进心肌再生的能力显著高于正常型间充质干细胞，本专利技术中的缺氧耐受型间充质干细胞能有效治疗急性心肌梗死。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1为不同氧气浓度对于间充质干细胞的增殖能力和旁分泌能力的检测结果；其中A为通过细胞计数统计间充质干细胞的增殖倍数；B为ELISA检测培养上清中细胞因子VEGF和HGF的释放量，C为westernblotting检测间充质干细胞内HIF-1α的表达量；图2为缺氧耐受型间充质干细胞(it-MSC)的表面标志物的流式分析结果图；A为P4代it-MSC的流式分析结果图，B为P10代it-MSC的流式分析结果图；图3为正常型间充质干细胞(N-MSC)和缺氧耐受型间充质干细胞(it-MSC)在严重缺氧条件下细胞死亡情况的流式检测结果；图4为N-MSC和it-MSC移植治疗急性心肌梗死大鼠模型中促进血管新生的检测结果；其中A为大鼠心肌组织的CD31、Hoechst免疫荧光染色结果，B为定量分析A中的CD31染色阳性区域；Vehicle表示溶液介质对照组；图5为N-MSC和it-MSC移植治疗急性心肌梗死大鼠模型中促进心肌再生的检测结果；其中A为大鼠心肌组织的Ki67、TnI和Hoechst免疫荧光染色结果，B为定量分析A中的Ki67染色阳性区域。具体实施方式下面给出一种根据本专利技术制备的缺氧耐受型间充质干细胞的非限定性的实施例。实施例1不同O2浓度对于间充质干细胞增殖能力和旁分泌功能的影响将脐带剪成1-1.5cm的小段，再用眼科剪顺着脐静脉腔剪开，将脐静脉和脐动脉去除，剥取华通氏胶。将剥好的华通氏胶放入一个盛有PBS的新培养皿内清洗，用另一新的眼科剪将华通氏胶剪成1-3mm3大小的组织块，以0.5-1.0cm间距将其接种于培养皿中，室温放置15min然后加入10mL完全培养基。将上述组织块置于不同氧气浓度(21％、16％、11％、6％、1％)环境中培养，待细胞的融合率达到80％以上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种缺氧耐受型间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)将脐带剪成1‑1.5cm的小段，将脐静脉和脐动脉去除，剥取华通氏胶；(2)将剥好的华通氏胶放入一个盛有PBS的培养皿内清洗，再将华通氏胶剪成1‑3mm

【技术特征摘要】
1.一种缺氧耐受型间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)将脐带剪成1-1.5cm的小段，将脐静脉和脐动脉去除，剥取华通氏胶；(2)将剥好的华通氏胶放入一个盛有PBS的培养皿内清洗，再将华通氏胶剪成1-3mm3大小的组织块，以0.5-1.0cm间距将其接种于培养皿中；(3)室温放置15min后加入10mL完全培养基，放入低氧培养箱内培养，CO2浓度控制为5％，O2浓度控制为1-6％，O2浓度通过N2平衡，温度为37℃；(4)待细胞的融合率达到80％以上时，用胰蛋白酶消化收集细胞，按照5000cells...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇军，左凤琼，幸倚帆，程威，谭小虎，
申请(专利权)人：成都康景生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51