【技术实现步骤摘要】
本申请涉及干细胞分离，具体而言，涉及一种脐带间充质干细胞的分离方法。
技术介绍
1、脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，uc-mscs)是一种来源于新生儿脐带间充质组织的干细胞，具有多能分化、自我更新和免疫调节等功能。脐带间充质干细胞被广泛应用于以组织修复和再生为目标的干细胞治疗中，具有广阔的临床应用前景。
2、人的脐带在胚胎期的第十五周形成，到正常分娩阶段，足月婴儿脐带平均长度在50cm～60cm，重量30g～60g不等，直径0.6cm～2cm不等。脐带间充质干细胞可以从脐带的不同部位分离获得，包括脐带血液、脐静脉内皮下层、脐带上皮层以及华通氏胶层等。其中，华通氏胶是指包绕在脐动脉和脐静脉周围并且含水量丰富的胶样组织，其富含大量且高质量的脐带间充质干细胞。
3、但是，目前，从华通氏胶中分离获得脐带间充质干细胞的方法，无法充分且有效地分离去除非目的细胞，且获得的脐带间充质干细胞相对较少，导致收获的脐带间充质干细胞的产量和纯度均较低；此外，现有的从脐带的华通氏胶中分离获得脐带间充质干细胞的方法普遍较为复杂，使得脐带组织和细胞在空气中暴露的时间较长，导致收获的脐带间充质干细胞的细胞活力会受到影响。
技术实现思路
1、本申请的目的在于提供一种脐带间充质干细胞的分离方法，其旨提高从华通氏胶中分离获得脐带间充质干细胞的产量、纯度和细胞活力。
2、本申请提供了一种脐带间充质干细胞的分离方法，该方法包括
3、本申请提供的脐带间充质干细胞的分离方法中，通过先将脐带截断为4cm～8cm的长度，有利于后续过程中能够更加容易且更加彻底地去除脐带上皮层和血管，进而有利于避免后续收获的脐带间充质干细胞中存在上皮细胞(即非目的细胞)而影响收获的脐带间充质干细胞的纯度的情况，同时也有利于避免由于剥离去除血管等操作时间过长而导致的脐带组织和细胞在空气中暴露的时间较长的情况，有利于避免脐带间充质干细胞受损，有利于提高收获的脐带间充质干细胞的细胞活力；并且，本申请通过对华通氏胶进行疏松处理，有利于大幅减少获得的华通氏胶组织中的上皮组织、羊膜和血管壁等残留，可使得华通氏胶组织更为均质，有利于提高收获的脐带间充质干细胞的产量和纯度。
4、在本申请可选的实施方式中，疏松处理的步骤包括：固定第一中间体的长度方向的一端，用手术刀从第一中间体被固定的一端刮向第一中间体的另一端，并保持手术刀相对水平方向倾斜30°～60°。
5、在上述技术方案中，可大幅减少获得的华通氏胶组织中的羊膜和血管壁等残留，可使得华通氏胶组织更为均质，有利于提高收获的脐带间充质干细胞的产量和纯度。
6、在本申请可选的实施方式中，脐带间充质干细胞的分离方法还包括：在截断前，使用磷酸盐缓冲液清洗脐带，并对脐带进行消毒处理。
7、在上述技术方案中，磷酸盐缓冲液可清洗掉脐带上残留的血渍等；消毒处理可获得无菌脐带组织。
8、可选地，消毒处理包括：将脐带浸泡于体积分数为70％～80％的乙醇水溶液中1.5～2.5min。
9、在本申请可选的实施方式中，剥离去除脐带段内的血管的步骤包括：使用组织镊将脐带段的上皮沿脐带段的螺旋走势撕开，逐层剖开组织，暴露脐带段内的静脉以及动脉后，将静脉和动脉从脐带段内剥离去除。
10、由于本申请先将脐带截断为4cm～8cm的长度，通过上述方式，可快速且较为彻底地去除脐带上皮层和血管，进而有利于避免后续收获的脐带间充质干细胞中存在上皮细胞(即非目的细胞)而影响收获的脐带间充质干细胞的纯度的情况，同时也有利于避免由于剥离去除血管等操作时间过长而导致的脐带组织和细胞在空气中暴露的时间较长的情况，有利于避免脐带间充质干细胞受损，有利于提高收获的脐带间充质干细胞的细胞活力。
11、在本申请可选的实施方式中，组织贴壁培养的步骤包括：将第二中间体剪切成组织块，将组织块平铺于第一培养容器中，并将第一培养容器倒置放置于细胞培养箱中进行第一孵育；向第一培养容器中加入培养基，将第一培养容器正置放置于细胞培养箱中进行第二孵育。其中，第一孵育的时间为20min～30min。
12、在上述技术方案中，在正置培养细胞(即第二孵育)之前，先将组织块平铺于第一培养容器中并倒置孵育培养(即第一孵育)，可提高后续正置培养细胞过程中组织块的贴壁牢固程度，有利于使得更多的脐带间充质干细胞从组织块中爬出，形成更多的细胞克隆群，进而有利于进一步提高最终收获的脐带间充质干细胞的产量。
13、在本申请可选的实施方式中，第二孵育的时间为12天～14天。
14、在上述技术方案中，第二孵育的时间在上述时间范围内，可使得收获的p0代脐带间充质干细胞具有良好的细胞形态和较高的细胞活力，同时也可以使得组织贴壁培养形成的细胞克隆群数量相对更多，进而有利于进一步提高最终收获的脐带间充质干细胞的产量。
15、在本申请可选的实施方式中，培养基包括：脐带间充质干细胞基础培养基、血小板裂解物以及l-谷氨酰胺；其中，血小板裂解物在培养基中的体积分数为4％～6％，l-谷氨酰胺在培养基中的摩尔浓度为1.6mm～2.4mm。
16、在上述技术方案中，第二孵育时使用的培养基采用上述培养基，有利于进一步提高组织贴壁培养形成的细胞克隆群数量，进而有利于进一步提高最终收获的脐带间充质干细胞的产量。
17、在本申请可选的实施方式中，组织块的体积为2mm3～3mm3。
18、在上述技术方案中，组织块的体积在上述范围内，可使得后续正置培养细胞过程中组织块的贴壁程度较为牢固，可使得较多的脐带间充质干细胞从组织块中爬出，形成较多的细胞克隆群，可提高最终收获的脐带间充质干细胞的产量。
19、在本申请可选的实施方式中，收获脐带间充质干细胞的步骤包括：向组织贴壁培养后的体系中加入胰酶进行第一消化处理，然后对第一消化处理后的体系进行第一过滤后，取第一过滤的滤出物，收获p0代脐带间充质干细胞；其中，第一过滤的孔径为60μm～80μm。
20、在上述技术方案中，采用60μm～80μm的孔径进行第一过滤，可较大程度地去除体系中的组织残留物、细胞碎片以及聚集的细胞团等，进而有利于避免体系中存在组织残留物、细胞碎片以及聚集的细胞团等残留而影响脐带间充质干细胞的细胞活力和细胞增殖能力。
21、可选地，收获脐带间充质本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述疏松处理的步骤包括：固定所述第一中间体的长度方向的一端，用所述手术刀从所述第一中间体被固定的一端刮向所述第一中间体的另一端，并保持所述手术刀相对水平方向倾斜30°～60°。
3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的分离方法还包括：在所述截断前，使用磷酸盐缓冲液清洗所述脐带，并对所述脐带进行消毒处理；
4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，剥离去除所述脐带段内的所述血管的步骤包括：使用组织镊将所述脐带段的上皮沿所述脐带段的螺旋走势撕开，逐层剖开组织，暴露所述脐带段内的静脉以及动脉后，将所述静脉和所述动脉从所述脐带段内剥离去除。
5.根据权利要求1～4任一项所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述组织贴壁培养的步骤包括：将所述第二中间体剪切成组织块，将所述组织块平铺于第一培养容器中，并将所述第一培养容器倒置放置于细胞培养箱中进行第一孵
6.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述第二孵育的时间为12天～14天。
7.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述培养基包括：脐带间充质干细胞基础培养基、血小板裂解物以及L-谷氨酰胺；其中，所述血小板裂解物在所述培养基中的体积分数为4％～6％；所述L-谷氨酰胺在所述培养基中的摩尔浓度为1.6mM～2.4mM。
8.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述组织块的体积为2mm3～3mm3。
9.根据权利要求1～4任一项所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述收获脐带间充质干细胞的步骤包括：向所述组织贴壁培养后的体系中加入胰酶进行第一消化处理，然后对所述第一消化处理后的体系进行第一过滤后，取所述第一过滤的滤出物，收获P0代脐带间充质干细胞；
10.根据权利要求9所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述收获脐带间充质干细胞的步骤还包括：将所述P0代脐带间充质干细胞接种于第二培养容器中进行细胞培养，然后向所述第二培养容器中加入胰酶进行第二消化处理，然后对所述第二消化处理后的体系进行第三过滤后，取所述第三过滤的滤出物，收获P1代脐带间充质干细胞；
...【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述疏松处理的步骤包括：固定所述第一中间体的长度方向的一端，用所述手术刀从所述第一中间体被固定的一端刮向所述第一中间体的另一端，并保持所述手术刀相对水平方向倾斜30°～60°。
3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的分离方法还包括：在所述截断前，使用磷酸盐缓冲液清洗所述脐带，并对所述脐带进行消毒处理；
4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，剥离去除所述脐带段内的所述血管的步骤包括：使用组织镊将所述脐带段的上皮沿所述脐带段的螺旋走势撕开，逐层剖开组织，暴露所述脐带段内的静脉以及动脉后，将所述静脉和所述动脉从所述脐带段内剥离去除。
5.根据权利要求1～4任一项所述的脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述组织贴壁培养的步骤包括：将所述第二中间体剪切成组织块，将所述组织块平铺于第一培养容器中，并将所述第一培养容器倒置放置于细胞培养箱中进行第一孵育；向所述第一培养容器中加入培养基，将所述第一培养容器正置放置于细胞培养箱中进行第二孵育；
...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓燕，李好，贺尚文，王晗，寇大莲，
申请(专利权)人：成都康景生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。