从组织中分离胎盘间质细胞并培养成间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及从组织中分离胎盘间质细胞并培养成间充质干细胞的方法，还涉及该方法中所用的混合酶消化液。具体的，所述方法包括以下步骤：胎盘小叶的处理、混合酶消化及终止、收集原代细胞、原代细胞冻存、细胞复苏、和细胞传代等步骤。使用本发明专利技术方法可以有效的提高从胎盘分离间充质干细胞的效率。例如所得原代细胞是一群较纯的间质细胞(CD73表达大于60％，CD45不表达)，每克组织获取细胞数可达2.5×10

Isolation of placental stromal cells from tissue and culture of mesenchymal stem cells

The present invention relates to a method for separating placental stromal cells from tissue and culturing them into mesenchymal stem cells, and also relates to the mixed enzyme digestion solution used in the method. Specifically, the method comprises the following steps: the treatment of placental lobules, digestion and termination of mixed enzymes, collection of primary cells, cryopreservation of primary cells, recovery of cells, passage of cells, and the like. The method can effectively improve the efficiency of separating the mesenchymal stem cells from the placenta. For example, the primary cells are a group of pure stromal cells (CD73 expression is greater than 60%, CD45 does not express), and the number of cells obtained per gram of tissue can reach 2.5 x 10

【技术实现步骤摘要】
从组织中分离胎盘间质细胞并培养成间充质干细胞的方法
本专利技术涉及从胎盘中分离干细胞的方法，特别涉及从胎盘中分离间充质干细胞的方法，更特别的是涉及一种使用本专利技术所述独特配方的消化酶组合物从而从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法。使用本专利技术方法可以有效的提高从胎盘分离间充质干细胞的效率。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(CaplanAI.Mesenchymalstemcells.JOrthopRes.1991,9:641-650.PittengerMF,MackayAM,BeckSC,etal.Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每105～106个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。现有的从胎盘中分离干细胞从而建立胎盘干细胞库的方法尚有诸多缺点，例如纯度不足、和/或数量不高，进而显示出这些方法尚不能满足人们的期待。例如CN101270349A(中国专利申请号200810061267.6，公开日2008年9月24日)公开的题为“胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法”的专利技术；CN101693884A(中国专利申请号200910117522.9，公开日2010年4月14日)公开的题为“一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的专利技术；CN102146359A(中国专利申请号201110005964.1，公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的专利技术。另外，中国专利申请号201210044648X公开了一种从胎盘中分离间充质干细胞的方法。这些方法在提取物的纯度和/或回收率方面是有待进一步改善的。本领域仍然需要有新的从胎盘中分离干细胞的方法，特别是高效地从胎盘中分离间充质干细胞的方法。此外，本领域仍然需要的新的用于从胎盘中分离间充质干细胞方法中使用的消化酶组合物，以期提高从胎盘中分离间充质干细胞的方法效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有获取胎盘间充质干细胞方法的不足，提供一种实用、简单、高效的从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法并任选地建立胎盘干细胞库的方法。同时，本专利技术的另一目的在于为上述从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法提供一种消化酶组合物。本专利技术人发现采用特别的操作方法以及特别组方的消化酶组合物，所获得的细胞纯度高和/或细胞回收率高。本专利技术基于此发现而得以完成。因此，本专利技术第一方面提供了从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm3左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；[其中，所述的组织清洗液是包含1％双抗的0.9％生理盐水](2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；[其中，所述的混合酶消化液中包含：15～30体积的Hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的LiberaseMNP-S酶、0.2～2体积的DNAI型酶(例如20～25体积的Hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的LiberaseMNP-S酶、0.5～1体积的DNAI型酶，例如22体积的Hank’s平衡盐溶液、0.4体积的LiberaseMNP-S酶、0.7体积的DNAI型酶)；所述LiberaseMNP-S酶例如是罗氏公司的LiberaseMNP-S酶，例如购自西宝生物，其货号：5578582001](3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；[此原代细胞的细胞悬液可以用sysmex血液分析仪进行细胞计数](4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；[其中，所述冻存液的配方为：65％的DMEM-F12、15％的人血清白蛋白(HSA)、20％的DMSO例如WAK品牌的DMSO](5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm2时可进行接下来的传代；[其中，所述完全培养基是包含10％FBS的DMEM-F12培养基](6)细胞传代：本文档来自技高网...

【技术保护点】
从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm

【技术特征摘要】
1.从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm3左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；(2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的FBS以终止消化；(3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加DMEM-F12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的DMEM-F12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；(4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；(5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个T75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm2时可进行接下来的传代；(6)细胞传代：取P0代细胞用PBS清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm2，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代、P3代至P4代、P4代至P5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：许晓椿，陆晗燕，王正，朱业峰，
申请(专利权)人：广州中科博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44