一种血管化组织工程脂肪瓣的体内构建方法技术

本发明专利技术公开了一种血管化组织工程脂肪瓣的体内构建方法，构建方法通过1)脂肪干细胞的分离培养与流式细胞术检测；2)免疫磁珠分选CD54(+)脂肪干细胞与体外标记；3)HIF‑1α基因修饰CD54(+)脂肪干细胞及其体外扩增；4)HIF‑1α基因修饰的CD54(+)脂肪干细胞与胶原海绵支架混合后植入动物体内，12周后将移植物取出，组织学检测鉴定新生血管化组织工程脂肪瓣的生物学特征。本发明专利技术有益效果：本发明专利技术为脂肪干细胞应用于组织工程、再生医学研究及其在临床上促进创伤修复、组织再生及美容抗衰老等治疗提供可靠的理论依据。

In vivo construction of a vascularized tissue-engineered adipose flap

The invention discloses a vascularized tissue engineering fat flap in vivo construction method, construction method by 1) cells and flow cytometry to detect fat stem; 2) immunomagnetic separation of CD54 (+) adipose derived stem cells and in vitro marker; 3) HIF 1 alpha gene modified CD54 (+) fat stem cells and in vitro amplification; 4) HIF alpha 1 gene modified CD54 (+) adipose derived stem cells and collagen sponge scaffold after implantation of mixed animal, 12 weeks after graft removal, histological detection and identification of biological characteristics of vascularized tissue engineering fat flap. The invention has the advantages that the invention is adipose stem cells used in tissue engineering and regenerative medicine research and promote tissue regeneration and wound healing, beauty anti-aging in clinic and provide a reliable theoretical basis for treatment.

【技术实现步骤摘要】
一种血管化组织工程脂肪瓣的体内构建方法
本专利技术属于生物医学
，具体是一种血管化组织工程脂肪瓣的体内构建方法；
技术介绍
由于创伤、疾病、感染、肿瘤切除等原因导致的软组织缺损是临床上经常需要解决的问题，目前应用于软组织重建的材料如胶原蛋白、透明质酸、硅胶及其他填充材料具有高成本、免疫原性、致敏性及传递传染性疾病的缺点。自1893年以患者自体游离的小块脂肪组织充填治疗面部软组织凹陷开始，自体脂肪组织以其具有来源丰富、取材方便、创伤小、无免疫排斥反应、相对安全且并发症相对较少等特点，至今仍是软组织修复重建及体表器官畸形矫正或再造的常用方法之一。然而，自体脂肪移植术后因血供不足导致植入的脂肪组织被大量吸收和脂肪细胞凋亡，严重地影响远期效果及受术者的满意度，移植后的脂肪吸收、坏死、纤维化、囊肿形成和钙化是脂肪移植的主要并发症和主要缺点，移植的脂肪组织由于组织吸收体积收缩并导致原始移植体积20％～90％的丢失[CherubinoM,MarraKG.Adipose-derivedstemcellsforsofttissuereconstruction.RegenMed,2009,4(1)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血管化组织工程脂肪瓣的体内构建方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：1)脂肪干细胞的分离培养与流式细胞术检测：切取健康成年新西兰大白兔腹股沟皮下脂肪组织约5ml，剔除血管及筋膜后，磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，将脂肪组织充分剪碎至体积约1.0mm

【技术特征摘要】
1.一种血管化组织工程脂肪瓣的体内构建方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：1)脂肪干细胞的分离培养与流式细胞术检测：切取健康成年新西兰大白兔腹股沟皮下脂肪组织约5ml，剔除血管及筋膜后，磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，将脂肪组织充分剪碎至体积约1.0mm3，用质量浓度为0.1％的Ⅰ型胶原酶恒温消化50～60min，用5ml的完全培养基中和后，用转速为1300rpm/min的离心机离心5min，去除杂质及上清液，沉淀混悬后用200目尼龙网过滤，再用完全培养基将细胞混悬，按1×105接种于25cm2的培养瓶中，置于体积浓度为5％CO2中饱和湿度，在37℃恒温培养箱中进行单层细胞培养，24h后首次更换完全培养基，以后每3～4d换完全培养基1次并动态观察细胞的生长特性，7～10d细胞生长融合达80％～90％后，此时细胞称为原代脂肪间干细胞记为ASCs-P0，经质量浓度为0.25％胰酶消化后，按1∶3进行传代培养，第三代细胞记为ASCs-P3；用流式细胞术检测ASCs-P3细胞表面CD29(+)、CD44(+)、CD49d(+)、CD90(+)、CD105(+)、HLA-ABC(+)及CD34(-)、CD45(-)、CD106(-)后备用；所述完全培养基由高糖培养基+质量浓度为10％胎牛血清+质量浓度为1％青霉素+质量浓度为1％链霉素组成；2)免疫磁珠分选CD54(+)脂肪干细胞与体外标记：采用免疫磁珠分选出第三代CD54(+)脂肪干细胞并经增强型绿色荧光蛋白标记细胞，具体分选步骤如下，(1)离心收集待分离细胞，用少量孵育液充分混悬0.5ml/1×108细胞，加入最终浓度为10～20μg/ml的一抗，在4℃条件下孵育30分钟；所述孵育液由质量浓度为0.5％牛血清白蛋白、质量浓度为0.08％乙二胺四乙酸pH为7.2的磷酸缓冲盐溶液组成，并真空抽滤除菌及液体内气体；(2)用20倍体积孵育液洗细胞一次，再加孵育液于0.3ml/1×108细胞中充分混悬细胞后，加入相应二抗包被的超微磁珠，混匀后在温度为8～15℃条件下孵育10～15分钟；(3)将分离柱安装入磁场中，加入0.5ml孵育液，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱；(4)将步骤(2)孵育完毕的细胞悬液加到分充柱中，自然流尽；(5)以0.5ml的孵育液加入分离柱中，自然流尽，流柱2次；(6)从磁场中取下分离柱，插在试管口上，加入1～2ml的孵育液，用针芯...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎洪棉，梁至洁，朱丹丹，吴芳晓，何宁，
申请(专利权)人：黎洪棉，
类型：发明
国别省市：广西,45