一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法技术

本发明专利技术公开了一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法，方法通过(1)富血小板纤维蛋白胶的提取、(2)特殊完全培养基的配制、(3)原代脂肪间充质干细胞的分离培养与传代培养和(4)不同类型脂肪间充质干细胞扩增后的生物学特征四个步骤完成。本发明专利技术获取了一种高纯度的CD54(+)脂肪间充质干细胞群，这群细胞具有较强的克隆形成能力、自我更新能力和成脂分化潜能，为在体外获取大量的具有干性的种子细胞运用于脂肪组织再生提供了新的方法，对提高临床上软组织损伤修复或先天性体表器官软组织缺陷畸形提供一种新的治疗策略，同时，也为确保其将来在临床应用的安全性提供充分的理论依据。

Expansion culture method for adipose mesenchymal stem cell clone

The present invention discloses a kind of adipose derived mesenchymal stem cell cloning method for amplification and culture, through the method of (1) extraction of platelet rich fibrin glue, (2) the preparation of special complete medium, (3) primary isolation of adipose derived mesenchymal stem cells cultured and subcultured and (4) of different types adipose derived mesenchymal stem cells after amplification of biological characteristics of four steps. The present invention obtains a high purity of CD54 (+) adipose derived mesenchymal stem cells, these cells have strong colony forming ability and the ability to self renew and adipogenic differentiation potential, which provides a new method for obtaining a large number of in vitro dry seed cells used in adipose tissue regeneration, at the same time soft tissue defects and provide a new therapeutic strategy to improve clinical soft tissue repair or congenital organs on the body surface, to ensure the safety of clinical application and provide a theoretical basis for the full.

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法
本专利技术属于生物医学
，具体是一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法。它涉及一种人类脂肪间充质干细胞克隆的高效扩增培养方法及相关生物学功能鉴定。
技术介绍
自从2001年Zuk等首次发现脂肪组织中含有多向分化潜能的间充质干细胞以来，脂肪间充质干细胞就逐渐成为了成体干细胞中最有前景的种子细胞之一。脂肪组织通过脂肪抽吸术或者外科手术易于获取，对供体的创伤相对较小，而且不涉及伦理问题，成为细胞治疗和组织工程应用中的理想工具，目前已有不少报道证实，脂肪间充质干细胞在皮肤软组织缺损、骨和软骨损伤、中枢神经系统疾病、肝硬化以及自身免疫性疾病等具有广阔的临床应用前景[PhilipsBJ,MarraKG,RubinJP.Healingofgraftedadiposetissue:currentclinicalapplicationsofadipose-derivedstemcellsforbreastandfacereconstruction.WoundRepairRegen,2014,22Suppl1:11-3.Guillaume-JugnotP,DaumasA,MagalonJ,SautereauN,VeranJ,MagalonG,etal.Autologousfatgraftandadiposetissue-derivedstromalvascularfractioninjectionforhandtherapyinsystemicsclerosispatients.2016,CurrResTranslMed,64(1):35-42.TissianiLA,AlonsoN.AProspectiveandControlledClinicalTrialonStromalVascularFractionEnrichedFatGraftsinSecondaryBreastReconstruction.StemCellsInt,2016,2016:2636454.]。然而，在将脂肪间充质干细胞临床应用转化过程中，却发现运用常规培养技术极其难以获得大量的能够保持干细胞稳定“干性”的脂肪间充质干细胞以供临床需要[BunnellBA,FlaatM,GagliardiC,PatelB,RipollC.Adipose-derivedstemcells:isolation,expansionanddifferentiation.Methods,2008,45(2):115-20.ChengNC,ChenSY,LiJR,YoungTH.Short-termspheroidformationenhancestheregenerativecapacityofadipose-derivedstemcellsbypromotingstemness,angiogenesis,andchemotaxis.StemCellsTranslMed,2013,2(8):584-94.]。按照目前从动物实验获得的数据，间充质干细胞的成人最低有效治疗剂量在(1.0-2.0)×106/kg，即一个体质量75kg的成年人约需输注(0.75-1.5)×108个细胞，不仅如此，为了维持稳定的疗效，经常需要针对同一病症进行阶段性的多次输注治疗[MurphyMB,MoncivaisK,CaplanAI.Mesenchymalstemcells:environmentallyresponsivetherapeuticsforregenerativemedicine.ExpMolMed,2013；45:e54.FernándezValloneVB,RomaniukMA,ChoiH,LabovskyV,OtaeguiJ,ChasseingNA.Mesenchymalstemcellsandtheiruseintherapy:whathasbeenachieved？Differentiation,2013,85(1-2):1-10.DoornJ,MollG,LeBlancK,etal.Therapeuticapplicationsofmesenchymalstromalcells:paracrineeffectsandpotentialimprovements.TissueEngPartBRev,2012；18(2):101-115.]。因此需要建立一个稳定高效的体外培养扩增体系，使有限的初始细胞经扩增后能够达到足够的细胞数量并具有特定分化功能以满足临床的需求。如何在体外扩增过程中最大限度地收获间充质干细胞，同时保持干细胞的生理特性是临床细胞实验室急待解决的关键问题。在传统培养基中，间充质干细胞容易丧失自我更新能力，极易老化，或“自发性”分化为成骨细胞、脂肪细胞或成纤维细胞[MarkP,KleinsorgeM,GaebelR,LuxCA,ToelkA,PittermannE,DavidR,SteinhoffG,MaN.HumanMesenchymalStemCellsDisplayReducedExpressionofCD105afterCultureinSerum-FreeMedium.StemCellsInt,2013；2013:698076.TsangWP,ShuY,KwokPL,ZhangF,LeeKK,TangMK,LiG,ChanKM,ChanWY,WanC.CD146+humanumbilicalcordperivascularcellsmaintainstemnessunderhypoxiaandasacellsourceforskeletalregeneration.PLoSOne,2013,8(10):e76153.ZhangD,KilianKA.Theeffectofmesenchymalstemcellshapeonthemaintenanceofmultipotency.Biomaterials,2013,34(16):3962-9.]；目前大量的研究证实，干细胞在体外扩增过程中“干性”的丧失提示，在体内微环境中维持间充质干细胞的多种关键因子在传统培养体系中缺失所致，[ScaddenDT.Thestem-cellnicheasanentityofaction.Nature,2006,441(7097):1075-9.SharmaMB,LimayeLS,KaleVP.Mimickingthefunctionalhematopoieticstemcellnicheinvitro:recapitulationofmarrowphysiologybyhydrogel-basedthree-dimensionalculturesofmesenchymalstromalcells.Haematologica,2012,97(5):651-60.]；因此，在培养体系中提供足够含量的多种必需细胞因子对细胞微环境的体外再造以有效保持干细胞特性可能是必需的。自2005年以来，我们的研究团队以人类不同解剖部位的皮下脂肪为组织来源，建立了自己的一整套实验技术平台及方法，进一步优化了脂肪间充质干细胞的分离培养方案，并对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)富血小板纤维蛋白胶的提取抽取患者50～100ml的静脉血，分装于无菌负压试血管内，采用转速2700rpm/min高速离心机离心，离心时间为12min，提取富含细胞因子的凝胶状物质，静置5min，即可得到富血小板纤维蛋白凝胶，此时血液分3层：最上层是贫血小板血浆，为淡黄色透明清亮液体；中间层是富血小板纤维蛋白，为淡黄色凝胶状物质；最下层是红细胞碎片，为暗红色物质；排出其中多余的红细胞，将富血小板纤维蛋白和贫血小板血浆一起加入含体积分数100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，放置于4℃冰箱储存备用，7d后采用酶联免疫吸附试验检测培养基中各种细胞因子的浓度显示，血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子‑β1、表皮生长因子、白细胞介素‑4、白细胞介素‑6、基质金属蛋白酶‑1和胰岛素样生长因子‑1的浓度峰值在提取后第7d，之后呈缓慢下降，但储存28d时仍保持较高的细胞因子水平；(2)特殊完全培养基的配制DMEM高糖培养基500ml+100ml静脉血分离提取的富血小板纤维蛋白和贫血小板血浆+1％青霉素、链霉素，4℃保存备用；(3)原代脂肪间充质干细胞的分离培养与传代培养在患者大腿上段内外侧或下腹部，采用低负压抽取脂肪组织50ml，采用转速为600rpm/min离心机离心，离心时间为2min，用0.1％的Ⅰ型胶原酶恒温消化40～50min，以步骤(2)等量的特殊完全培养基中和后采用转速为1300rpm/min离心机离心、离心时间为5min，去除杂质及上清，沉淀混悬后用200目尼龙网过滤，再用特殊完全培养基将细胞混悬，按1×10...

【技术特征摘要】
1.一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)富血小板纤维蛋白胶的提取抽取患者50～100ml的静脉血，分装于无菌负压试血管内，采用转速2700rpm/min高速离心机离心，离心时间为12min，提取富含细胞因子的凝胶状物质，静置5min，即可得到富血小板纤维蛋白凝胶，此时血液分3层：最上层是贫血小板血浆，为淡黄色透明清亮液体；中间层是富血小板纤维蛋白，为淡黄色凝胶状物质；最下层是红细胞碎片，为暗红色物质；排出其中多余的红细胞，将富血小板纤维蛋白和贫血小板血浆一起加入含体积分数100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，放置于4℃冰箱储存备用，7d后采用酶联免疫吸附试验检测培养基中各种细胞因子的浓度显示，血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子-β1、表皮生长因子、白细胞介素-4、白细胞介素-6、基质金属蛋白酶-1和胰岛素样生长因子-1的浓度峰值在提取后第7d，之后呈缓慢下降，但储存28d时仍保持较高的细胞因子水平；(2)特殊完全培养基的配制DMEM高糖培养基500ml+100ml静脉血分离提取的富血小板纤维蛋白和贫血小板血浆+1％青霉素、链霉素，4℃保存备用；(3)原代脂肪间充质干细胞的分离培养与传代培养在患者大腿上段内外侧或下腹部，采用低负压抽取脂肪组织50ml，采用转速为600rpm/min离心机离心，离心时间为2min，用0.1％的Ⅰ型胶原酶恒温消化40～50min，以步骤(2)等量的特殊完全培养基中和后采用转速为1300rpm/min离心机离心、离心时间为5min，去除杂质及上清，沉淀混悬后用200目尼龙网过滤，再用特殊完全培养基将细胞混悬，按1×105/ml接种于25cm2的培养瓶中，置于体积浓度为5％CO2中饱和湿度、在37℃恒温培养箱进行单层细胞培养，24～48h后更换培养液一次，以后每3～4d换液1次并动态观察细胞的生长特性，7～10d细胞生长融合达80％～90％后，此时细胞称为原代脂肪间充质干细胞记为ASCs-P0，经0.25％胰酶消化，按1∶3进行传代培养，第一代细胞记为ASCs-P1。选取生长良好的ASCs-P1代细胞进行流式细胞术检测CD29、CD44、CD45、CD49d、CD54、CD105、CD106表面分子阳性细胞数，同时用免疫磁珠分选法将ASCs-P1进行分选，获取CD54(+)ASCs-P1，将获得的CD54(+)ASCs-P1用特殊完全培养基培养并进行继续传代扩增，将CD54(+)ASCs-P3、CD54(+)ASCs-P10分别与胶原蛋白海绵支架形成复合物，在成脂诱导培养基中体外培养至7d，取出材料，用2.5％戊二醛固定，用梯度酒精脱水，临界点干燥，横截面表面喷...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎洪棉，梁至洁，朱丹丹，吴芳晓，何宁，
申请(专利权)人：黎洪棉，
类型：发明
国别省市：广西,45