一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法，属于生物技术领域，采用的技术手段是，在原代分离MSC时采用分次消化结合组织培养法的方法，并综合控制消化时间、二次消化液比例，通过利用消化液组分及细胞间的相互作用，大大提高了细胞的分离数量和贴壁成活率，对细胞损伤小，更大程度的保护间充质干细胞的活性和分化潜能。进一步改良了培养基组分，加入并控制三种添加成分的含量及比例，对脐带间充质干细胞的贴壁生长、活力保持、增殖能力具有协同促进功效，有利于高效获得大量成活率高、活力好、分化能力好的间充质干细胞。

Method for efficiently separating and culturing umbilical cord mesenchymal stem cells

The invention discloses a high efficient separation of umbilical cord mesenchymal stem cells, which belongs to the field of biotechnology, technical means are used in primary MSC with differential digestion combined with tissue culture method, and comprehensive control of digestion time, two digestion ratio by using the interaction of digestive juice the components and between cells, greatly improving the separation number of cells and adherent cells on the survival rate, less injury, more protected mesenchymal stem cell activity and differentiation potential. The further improvement of the medium composition, join and control content and the ratio of three kinds of additives, have a synergistic effect on umbilical cord mesenchymal stem cells adherent growth, viability, proliferation ability, is conducive to the efficient access to a large number of high survival rate, good viability and differentiation ability of mesenchymal stem cells.

【技术实现步骤摘要】
一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法。
技术介绍
人脐带间充质干细胞(MSC)是一群具有高度自我更新能力和分化潜能的成体干细胞，在适当的诱导条件下能向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经细胞等多种组织细胞分化，加之其具有免疫调控、分泌细胞因子、取材方便等优点，MSC的分离、培养、分化、诱导植入等研究备受关注，在细胞治疗、组织工程等领域显示出日益广阔的应用前景。自1995年首次报道MSC应用于临床试验，目前培养的MSC已被广泛地用于临床试验研究，如脊髓损伤、软骨和骨损伤、充血性心衰、急性心梗、Ⅱ型糖尿病等，而且在肾脏、肌肉和肺等组织损伤修复研究也有初步进展。研究表明MSC能够植入肌肉退化组织并向肌细胞分化，也能够促进造血干细胞的植入，MSC还可应用于软骨组织重建等生物工程；也可能成为未来抗癌治疗中携带自杀基因或抗癌腺病毒药物的载体细胞。然而，要达到临床应用的细胞数量级及应用效果，就对原始干细胞的数量、活力及分化能力要求很高，目前分离和培养人脐带MSC的方法大致有胶原酶II消化法、组织块贴壁法、脐静脉内膜消化法，在培养应用或后期细胞性能检测中，上述各方法操作步骤、分离效果及弊端凸显。上述方法所初始分离的MSC数量有限，致使达到细胞融合80-90％多需6-15天，而要达到临床应用的细胞数量级则必须还要经体外培养多次传代，这些过程中，原代细胞生长时间过长、且传代次数过多，最终细胞极易发生老化，活力大减，难以保证临床应用时的效果。另一方面，培养扩增中细胞密度、培养环境的优化关系MSC培养效率和安全。目前，一般采用含10-20％胎牛血清(FBS)的DMEM或α-MEM培养基，但在培养过程中，血清含量高，一方面使得细胞易于分化为脂肪细胞从而改变干细胞特效，另一方面，较多的血清蛋白因细胞内化而残留在胞浆中，有引发患者过敏的风险。近些研究有采用无血清条件下培养扩增，但这种培养方式需在培养基加大量的生长因子以维持细胞的生长繁殖，且这样造成细胞不易贴壁，造成传代培养中细胞损失严重，大量扩增困难较大。上述种种原因，给目前的新生儿脐带血存储用户带来了风险和应用缺失，还使其收到了较大的经济损失，更导致目前诸多用户对该技术存在技术疑虑，脐带血存储难以推广。综上可见，获得大量的活力充足、分化潜能高的干细胞进行冻存，才能保证广大脐带血存储者应用时起到良好疗效，为人类生命健康保驾护航，因此，脐带干细胞分离培养及扩增技术是本领域一直亟需改进的技术难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法，用以解决现有脐带间充质干细胞原代分离细胞数量少、增殖慢、扩增易老化的技术问题。为实现上述目的，本专利技术方法通过调整消化酶的组成及消化时间、进一步借助细胞与组织上未脱落细胞之间的相互作用，最大程度的保护细胞、提高细胞贴壁效率和增殖效率，从而保证了细胞的活力、增殖、分化潜能，高效获得大量间充质干细胞。具体地，本专利技术高效分离培养脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：(1)将离体脐带以生理盐水冲洗至无血块，浸没至PBS或生理盐水中剪至0.25-0.35cm3碎块，2500-3000rpm离心1min得脐带组织块沉淀，弃上清；(2)向脐带组织块沉淀加入等体积的Ⅱ型胶原酶，吹打均匀，密封置于37℃摇床20-40min，吹打均匀后静置，移液枪收集含MSC的Ⅱ型胶原酶液转移至MEM培养液中，2500-3000rpm离心3min，弃上清，以完全培养基重悬细胞，置于37℃、5％CO2培养箱，剩余脐带组织块转入步骤(3)；(3)向剩余脐带组织块加入等体积的混合酶溶液进行二次消化20-40min，至脐带组织块剩余30-40％体积，一并转移至步骤(2)中的完全培养基中，吹打均匀，以0.5～1×106cells/cm2的密度种于T75培养瓶，37℃、5％CO2培养箱36-48h，其中混合酶溶液由0.05-0.1％Ⅱ型胶原酶溶液和0.05-0.1％Ⅰ型胶原酶溶液以体积比6-8：2-4均匀混合组成；(4)吸除旧培养基，更换为含有10％FBS、1％双抗、3万U单位庆大霉素的改良培养基继续培养48-72h；(5)轻轻晃动培养瓶去除组织及漂浮细胞，PBS或生理盐水再次冲洗后，加入胰蛋白酶37℃消化至70～80％细胞脱落，加入改良培养基终止消化，吸管吹打培养瓶底部，转移至离心管，2500-3000rpm离心3-5min，弃上清，重悬计数，按照3000～5000cells/cm2的密度种于培养瓶传代；(6)每3天换液一次，培养3-5天待细胞长至70～80％融合度，重复步骤(5)，传代扩增到第5或第6代，即可得足量间充质细胞用于实验或冻存。优选的，所述步骤(3)中，二次消化20-40min后，首先以移液枪收集含MSC的混合酶溶液并以100目筛过滤后，再与所剩余的30-40％体积脐带组织块一并转移至步骤(2)中的完全培养基中。更优选的，所述步骤(3)中培养36-48h过程中，在培养瓶周边施加100-150GS的静磁场作用10-15h。更优选的，混合酶溶液由0.05-0.1％Ⅱ型胶原酶溶液和0.05-0.1％Ⅰ型胶原酶溶液以体积比6-8：2-4均匀混合组成；更优选的，所述改良培养基由MEM基础培养基添加10％FBS、1％双抗、3万U单位庆大霉素和抗坏血酸、胆固醇、木糖醇组成。优选的，所述抗坏血酸、胆固醇、木糖醇的浓度分别为10-20μg/mL、15-40μg/mL、60-100μg/mL。更优选的，所述抗坏血酸、胆固醇、木糖醇的含量比例为1：1.5-2：4-5。本专利技术方法具有如下优点：(1)本专利技术分离MSC时才有两步消化法并控制消化时间段，对细胞损伤小，更大程度的保护间充质干细胞的活性和分化潜能，有利于其高成活率，二步消化时采用特定比例的两种酶，无需离心，有效提高了细胞贴壁成活率；(2)进一步改进的技术方案中，二步消化细胞过筛破损少量细胞，在提高单细胞数量的同时，获得了有利于细胞信号传导的胞浆，大大提高了残余组织上细胞的爬出，提高了细胞的原代分离量和贴壁效率；加入静磁场，改善细胞周期，有利于细胞的生长和增殖能力，利于高效快速获得大量干细胞；(3)改良培养基中加入并控制三种添加成分的含量及比例，对提高脐带间充质干细胞的贴壁生长、活力保持、增殖能力具有协同促进功效，有利于高效获得大量成活率高、活力好、分化能力好的间充质干细胞。附图说明图1是实施例3成骨细胞分化测试中A1组的代表性示例照片；图2是实施例3成骨细胞分化测试中B2组的代表性示例照片；图3是实施例4成脂肪细胞分化测试中A2组的代表性示例照片；图4是实施例4成脂肪细胞分化测试中B2组的代表性示例照片；图5是实施例4成脂肪细胞分化测试中C2组的代表性示例照片；图6是实施例4成脂肪细胞分化测试中D2组的代表性示例照片。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1本实施例具体说明本专利技术所提供的高效分离培养脐带间充质干细胞的方法，同时设置平行实验与目前常规分离比较所获得干细胞的数量，下述方法及试剂，如无特殊说明，均为常规操作和配制方法。(一)实验前，对实验环境进行如下无菌处理：1、用84消毒液按说明书配制水溶液擦本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将离体脐带以生理盐水冲洗至无血块，浸没至PBS或生理盐水中，剪至0.25‑0.35cm

【技术特征摘要】
1.一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将离体脐带以生理盐水冲洗至无血块，浸没至PBS或生理盐水中，剪至0.25-0.35cm3碎块，2500-3000rpm离心1min得脐带组织块沉淀，弃上清；(2)向脐带组织块沉淀加入等体积的Ⅱ型胶原酶，吹打均匀，密封置于37℃摇床20-40min，吹打均匀后静置，移液枪收集含MSC的Ⅱ型胶原酶液转移至MEM培养液中，2500-3000rpm离心3min，弃上清，以完全培养基重悬细胞，置于37℃、5％CO2培养箱，剩余脐带组织块转入步骤(3)；(3)向剩余脐带组织块加入等体积的混合酶溶液进行二次消化20-40min，至脐带组织块剩余30-40％体积，一并转移至步骤(2)中的完全培养基中，吹打均匀，以0.5～1×106cells/cm2的密度种于T75培养瓶，37℃、5％CO2培养箱36-48h，其中混合酶溶液由0.05-0.1％Ⅱ型胶原酶溶液和0.05-0.1％Ⅰ型胶原酶溶液以体积比6-8：2-4均匀混合组成；(4)吸除旧培养基，更换为含有10％FBS、1％双抗、3万U单位庆大霉素的改良培养基继续培养48-72h；(5)轻轻晃动培养瓶去除组织及漂浮细胞，PBS或生理盐水再次冲洗后，加入胰蛋白酶37℃消化至70～80％细胞脱落，加入改良培养基终止消化，吸管吹打培养瓶底部，转移至离心管，2500...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘爽，陈睿，张青，佘燕玲，沈慧娟，黎程，
申请(专利权)人：广东省第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东,44