自体脂肪间充质干细胞的培养方法和使用的培养基技术

本发明专利技术涉及自体脂肪间充质干细胞的培养方法和使用的培养基。具体的说，本发明专利技术涉及的培养方法包括如下步骤培养预处理、贴壁培养、补液与换液、一次或任选的多次的细胞传代、以及任选的制备脂肪间充质干细胞的制剂和任选的对所得脂肪间充质干细胞进行细胞冻存、复苏。本发明专利技术的培养基中包括DMEM和FBS。使用本发明专利技术培养基培养所述自体脂肪间充质干细胞特别是眼部脂肪细胞的自体脂肪间充质干细胞时，能够呈现本发明专利技术所述优异技术效果。得到的这些自体脂肪间充质干细胞可以用于自体应用，例如由眼部脂肪得到的自体脂肪间充质干细胞可用于面部注射，例如于面部皱纹、太阳穴、泪沟等部位的注射填充。

Culture methods and culture medium for autologous adipose derived mesenchymal stem cells

The present invention relates to the culture method of autologous adipose derived mesenchymal stem cells and the culture medium used. Specifically, the invention relates to a method for cultivating the culture includes the steps of pretreatment, adherent, fluid and liquid changing and optionally one or several cells, and optionally the preparation of adipose derived mesenchymal stem cells on Preparation and optionally the adipose derived mesenchymal stem cells for cryopreservation and recovery. The culture medium of the invention includes DMEM and FBS. When the autologous adipose derived mesenchymal stem cells are cultured by the culture medium of the invention, especially the autologous adipose derived mesenchymal stem cells of the eye fat cells, the excellent technical effect of the invention can be presented. These autologous adipose derived mesenchymal stem cells can be used for autologous applications, such as autologous adipose derived mesenchymal stem cells derived from ocular fat, which can be used for facial injection, such as filling in facial wrinkles, temples, tears and other areas.

【技术实现步骤摘要】
自体脂肪间充质干细胞的培养方法和使用的培养基
本专利技术属于生物
，涉及一种脂肪间充质干细胞的培养方法，特别是涉及一种自体脂肪间充质干细胞的培养方法，所述自体脂肪间充质干细胞特别是来源于眼部的自体脂肪间充质干细胞。本专利技术还涉及上述自体脂肪间充质干细胞培养中所用的培养基。使用本专利技术培养基培养所述自体脂肪间充质干细胞特别是眼部脂肪细胞的自体脂肪间充质干细胞时，能够呈现本专利技术所述优异技术效果。得到的这些自体脂肪间充质干细胞可以用于自体应用，例如由眼部脂肪得到的自体脂肪间充质干细胞可用于面部注射，例如于面部皱纹、太阳穴、泪沟等部位的注射填充。
技术介绍
皮肤老化是内源性和外源性因素共同作用，从而导致的皮肤衰老现象，主要表现为皮肤变薄松弛、干燥粗糙、弹性变差、皱纹形成、局部色素过度沉着及毛细血管扩张等等。内源性因素包括遗传因素和不可抗力因素，而紫外线照射、风吹、吸烟、高糖饮食和接触有害化学物质等造成的皮肤显著变化，则属于外源性老化。内源性皮肤老化表现为皮肤纹理细密，松弛和缺乏弹性；外源性皮肤老化表现为皱纹粗糙，质地不平整，肤色灰黄、伴色素沉着，弹性组织变性，以及毛细血管扩张等。自体脂肪组织是目前临床常用的长效组织填充材料，不仅容易获得，而且填充效果持久，无排异反应，可用于治疗凹陷瘢痕和较深的皱纹，还可明显改善皮肤质地，但脂肪组织移植会导致皮下脂肪容积的扩增。研究发现，脂肪组织中的脂肪间充质干细胞(ADSCs)对于维持脂肪组织的存活更新起到至关重要的作用。因此，使用ADSCs的面部应用成为面部抗衰老的可行途径。ADSCs是来源于脂肪的间充质干细胞，取材方便，其提取效率比骨髓间充质干细胞高40倍，并且体外培养条件下增殖速度更快；具有多向分化能力，可以向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞，甚至神经细胞分化。目前临床Ⅰ期和Ⅱ期实验都证明，ADSCs在心脏、直肠、乳腺等多种器官损伤修复中的应用是安全、有效的，而且已有研究证实ADSCs具有促进皮肤再生修复的作用。ADSCs在多个方面呈现出其固有的优势。ADSCs属于单核细胞家族，是成体干细胞中的一种。它来自处理过的脂肪组织，培养时在细胞培养皿中以贴壁、粘附方式生长，并具有多样分化的能力，不只分化为脂肪细胞，还可以分化为肌细胞、软骨细胞、神经细胞、血管内皮细胞、骨细胞等，因此它们也在组织工程中被广泛地应用。例如，ADSCs可通过自我复制分化为脂肪细胞，在组织再生中发挥作用；ADSCs可以分化成血管内皮细胞或周围细胞；ADSCs在缺氧或其他条件下，可以分泌血管生长因子；当ADSCs和脂肪细胞一起移植的时候，它能够分化成内皮细胞，阻止纤维化和脂肪坏死的发生，提高脂肪成活率；根据最近的许多具体研究结果表明，ADSCs能表达多种细胞因子VEGF、IGF、TGF-β1、bFGF、EGF等，还通过表达VEGF、IGF-1等血管生长因子，来阻止凋亡的发生，维持脂肪细胞的成活率。现有技术公开了诸多有关脂肪间充质干细胞的培养方法。例如，CN106479970A(201611050980.1)公开了一种大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法。本专利技术所述大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法向玻璃培养瓶中加入脂肪间充质干细胞培养基，在湿度95％、5％CO2的培养箱中于35℃温育平衡30分钟；调整脂肪间充质干细胞培养基的温度到35℃，pH7.05，加入预处理的微载体和脂肪间充质干细胞，5RPM～20RPM搅拌2h；升温至37℃于15RPM-40RPM、5％CO2条件下培养96h，期间补加脂肪间充质干细胞培养基。与现有方法相比，据信该专利技术大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法增殖后获得细胞更多，细胞活力和增殖能力强，且能很好保持脂肪间充质干细胞的形态和良好的干细胞特性。CN104762260A(201510197879.8)涉及一种脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：获得脂肪，预处理、酶解、离心，收集沉淀，获得脂肪间充质干细胞；步骤2：培养所述脂肪间充质干细胞，当所述脂肪间充质干细胞生长至80％融合时，弃培养液，加PBS清洗，再加EDTA～胰酶溶液消化，终止消化、离心，传代培养。据信该专利技术具有以下优势：1、培养得到的干细胞纯度高；2、回收脂肪间充质干细胞培养过程中分泌出的各类因子，可以显著促进表皮细胞的增殖，表明能加快表皮细胞的新生和更替，达到显著的抗衰老效果。CN104974984A(申请号201510173453.9)公开了一种脂肪组织来源的间充质干细胞的扩增培养方法，包括如下步骤：将分离的脂肪组织来源的间充质干细胞用脂肪干细胞培养基进行重悬处理，得到含间充质干细胞的重悬液；将所述重悬液接种至干细胞培养器中进行扩增培养；扩增培养24小时后更换所述脂肪干细胞培养基，之后每两天更换所述脂肪干细胞培养基一次，待生长融合至80～90％时，用胰酶消化处理后进行传代培养；其中，所述脂肪干细胞培养基含有0.1～10v/v％胎牛血清、1～10v/v％庆大霉素和80～98.9v/v％高糖DMEM培养基；所述干细胞培养器为用纤维粘连蛋白包被处理的干细胞培养器。据信该专利技术脂肪组织来源的间充质干细胞的扩增培养方法采用纤维粘连蛋白包被脂肪间充质干细胞生长依附的固相支持物，利用低浓度胎牛血清和高浓度庆大霉素的协同增效筛选培养，使得脂肪组织来源的间充质干细胞在两周时间内能扩增400-500倍，且纯度高，能定向诱导分化为脂肪组织。CN106520686A(申请号201610887111.8)提供了一种脂肪间充质干细胞的培养方法。本专利技术脂肪间充质干细胞培养方法包括如下培养步骤：将获取的原代脂肪间充质干细胞接种至干细胞培养基中进行培养处理，其中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素3因子，且所述干细胞因子与白介素3因子的含量比为(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。本专利技术培养方法能够提高脂肪间充质干细胞的扩增能力，并获得较高的迁移能力。CN101984049A(申请号201010580537.1)公开了一种从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)脂肪组织的获得：脂肪组织为专业的医院或者美容院通过肿胀法吸脂手术获得的废弃物，在无菌条件下，4-20℃储存小于48小时；(2)初步去除红细胞：脂肪抽取物静止放置待分层后，小心移除下层液体，用D-Hanks液洗涤多次至洗出液清亮；(3)消化脂肪抽取物：加入以D-Hanks液配制的一型胶原酶至0.01-2g/100ml，37℃下20-400转/min震荡消化15-120分钟；(4)脂肪干细胞的获得：将消化后产物在4℃、离心力450g条件下离心5min，脂肪干细胞培养基重悬，以100μm孔径滤膜过滤去除杂质最终获得脂肪干细胞；(5)再次去除红细胞，利用反复洗涤和红细胞裂解的方式再次去除红细胞；(6)脂肪干细胞计数、活性检测和培养：取100μl分离的细胞以细胞计数板进行细胞计数；同时取出100μl细胞通过苔盼蓝染色的方法进行活细胞计数，根据两个计数的结果按照3*104/cm2的密度接种于T-75培养瓶中，37℃、CO2浓度5％、湿度100％条件下进行培养。据信该专利技术方法能够利用小量的脂肪组织获得大量的状态良好、保持很本文档来自技高网...

【技术保护点】
脂肪间充质干细胞的培养方法，其包括如下步骤(1)培养预处理：将采集的脂肪转移至生物安全柜，倒入装有含青链霉素的PBS的培养皿中，使用无菌手术剪和无菌镊子取出脂肪上的血管和结缔组织，使用PBS清洗脂肪组织；(2)贴壁培养：将脂肪组织剪成4‑5mm

【技术特征摘要】
1.脂肪间充质干细胞的培养方法，其包括如下步骤(1)培养预处理：将采集的脂肪转移至生物安全柜，倒入装有含青链霉素的PBS的培养皿中，使用无菌手术剪和无菌镊子取出脂肪上的血管和结缔组织，使用PBS清洗脂肪组织；(2)贴壁培养：将脂肪组织剪成4-5mm3大小的碎块，取干净的10cm培养皿，用镊子将脂肪碎块贴于培养皿内，一个培养皿贴10-15块，在生物安全柜中晾干30min左右，每个培养皿添加10ml完全培养基；(3)补液与换液：每隔3天进行补液，添加约5ml完全培养基/皿，当有细胞爬出后，进行全换液，约10ml完全培养基/皿；当有成片细胞爬出后，将脂肪组织块去掉，并进行全换液；(4)细胞传代：(4a)清洗：将培养皿中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养皿中，约为5ml/皿，轻轻晃动培养皿，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；(4b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约3ml/皿)，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养皿时，轻拍培养皿，使所有细胞脱落并悬浮于培养皿中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养皿移至生物安全柜中；(4c)中止：每皿加入2～5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；(4d)收集：用移液管吸取培养皿中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养皿，确保所有细胞均被收集；(4e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；(4f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；(4g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T75培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天，得到P1代脂肪间充质干细胞；(4h)任选的，依照以上步骤(4a)至步骤(4g)的操作进行细胞传代，依次得到P2代至P5代脂肪间充质干细胞；(4i)任选的，使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行制剂的制备；(4j)任选的，使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行细胞冻存，任选的对所冻存的细胞进行复苏，以及任选的对复苏的细胞进行制剂的制备。2.根据权利要求1的培养方法，其中，当在细胞传代的过程中，在步骤(4g)的操作中，在融合率达到80-90％时，进行下一代的细胞传代或者进行制剂制备和/或细胞冻存。3.根据权利要求1的培养方法，其中，所述完全培养基组成为：10％FBS、0.2％丙二醇、0.05％果糖和DMEM。4.根据权利要求1的培养方法，其中，所述DMEM为低糖型DMEM。5.根据权利要求1的培养方法，其中，所述完全培养基组成为：100mL的FBS、丙二醇2g、果糖500mg、无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。6.根据权利要求1的培养方法，其中，所述脂肪是从眼袋和/或眼皮部位采集的眼部脂肪。7.根据权利要求1的培养方法，其中，所述细胞冻存使用的冻存液组成为：1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基。8.根据权利要求1的培养方法，其包括如下步骤：(1)培养预处理：将采集的脂肪转移至生物安全柜，倒入装有含青链霉素的PBS的培养皿中，使用无菌手术剪和无菌镊子取出脂肪上的血管和结缔组织，使用PBS清洗脂肪组织；(2)贴壁培养：将脂肪组织剪成4-5mm3大小的碎块，取干净的10cm培养皿，用镊子将脂肪碎块贴于培养皿内，一个培养皿贴10-15块，在生物安全柜中晾干30min左右，每个培养皿添加10ml完全培养基；(3)补液与换液：每隔3天进行补液，添加约5ml完全培养基/皿，当有细胞爬出后，进行全换液，约10ml完全培养基/皿；当有成片细胞爬出后，将脂肪组织块去掉，并进行全换液；(当培养皿中有若干片生长较密，成旋涡状的梭形细胞(作为P0代细胞)时，进行传代培养；)(4)P0代-P1代的细胞传代：(4a)清洗：将培养皿中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养皿中，约为5ml/皿，轻轻晃动培养皿，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；(4b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约3ml/皿)，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养皿时，轻拍培养皿，使所有细胞脱落并悬浮于培养皿中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养皿移至生物安全柜中；(4c)中止：每皿加入2～5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；(4d)收集：用移液管吸取培养皿中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养皿，确保所有细胞均被收集；(4e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；(4f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；(4g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T75培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天；(当培养瓶中细胞融合率达到80-90％时，为P1代细胞，可进行传代培养；)(5)P1-P2代的细胞传代：(5a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为10ml/T75培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；(5b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约3ml/T75瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；(5c)中止：每瓶加入2～5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；(5d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；(5e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；(5f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；(5g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T225培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天；(当培养瓶中细胞融合率达到80-90％时，为P2代细胞，进行传代培养；)(6)P2-P3代的细胞传代：(6a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；(6b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约5ml/T225瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李诣书，周丹，王正，
申请(专利权)人：广州中科博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44