培养干细胞的培养基组合物制造技术

本发明专利技术涉及用于培养干细胞的培养基组合物，且更具体地，涉及用于培养间充质干细胞的培养基组合物，其含有与多种半完全培养基(DMEM、a‑MEM、IMDM、F12和DMEM/F12)混合的基本培养基、L‑抗坏血酸2‑磷酸、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(b‑FGF)、胰岛素、N‑乙酰基‑L‑半胱氨酸、氯化钙和氢化可的松。根据本发明专利技术，能够改善间充质干细胞的增殖能力和分化能力，并且能够以与现有培养方法相比更低的价格培养间充质干细胞，由此可使用间充质干细胞更经济地生产细胞治疗产品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】培养干细胞的培养基组合物
本专利技术涉及用于培养干细胞的培养基组合物，且更具体地，涉及用于培养间充质干细胞的培养基组合物，其中培养基组合物包括基本培养基(其中多种准完全培养基(DMEM、α-MEM、IMDM、F12和DMEM/F12)和成分确定的角质形成细胞-SFM混合)、L-抗坏血酸2-磷酸、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、胰岛素、N-乙酰基-L-半胱氨酸、氯化钙和氢化可的松。相关技术的描述具有分化成两个或更多个细胞的能力同时保持自我复制能力的细胞被称为干细胞。干细胞可大体上分为全能(totipotent)干细胞、多潜能/亚全能(pluripotent)干细胞和多能(multipotent)干细胞，其可仅分化成组织和器官中的特定细胞。作为干细胞，成体干细胞是细胞的上位概念，其涉及诱导胎儿阶段、新生儿阶段和成人阶段的组织和器官发育，维持成体组织稳态和组织损伤的再生的功能。近来，成体干细胞在新的再生医疗技术如功能障碍或与各种疾病或事故不相容的生物组织和器官的再生和功能恢复的开发研究中一直引起关注。此外，因为预测细胞-组织替代疗法的发展超过常规经典药物疗法或手术治疗方法，使用干细胞的治疗技术的发展研究将导致干细胞的更大利用。因此，目前已经研究了干细胞的多种功能。其中，使用间充质干细胞的细胞疗法技术开始得到关注，并且正在开发用于改善以适于借助从人体分离的间充质干细胞进行治疗的技术(WO2006/019357、韩国专利注册号0795708和韩国专利注册号0818214)。目前，与使用成体干细胞的细胞疗法产品相关的研究和开发过程经过如下引入到患者本身的一系列过程进行：在自患者收集干细胞、血来源的单核细胞或骨髓来源的单核细胞之后，经体外培养诱导细胞增殖和/或分化，以及诱导未分化(干细胞和/或前体细胞)和/或分化细胞的植入。然而，目前使用并且最优化用于间充质干细胞的干细胞维持能力(干性)、高分裂能力和紧密形态保留的间充质干细胞培养基，由于高成本，是干细胞疗法产品研究中的经济负担(韩国专利注册号0795708)。在这方面，本专利技术人最大限度地开发了可降低间充质干细胞的生产成本并进一步增强培养效率的用于干细胞培养的培养基。结果，本专利技术人已开发了一种混合培养基，其中通常使用目前用于培养干细胞的具有高成本和高效率的KSFM-P培养基与相对便宜的准完全产品培养基或成品干细胞培养基以一定比例混合。此外，作为通过使用混合培养基培养间充质干细胞的结果，本专利技术人确认了干细胞的培养效率增加，并完成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于培养在具有高增殖能力的同时能够维持分化能力的干细胞的经济的培养基组合物。本专利技术的另一目的是提供使用所述培养基组合物培养间充质干细胞的方法。为了实现上述目的，本公开内容提供了用于培养间充质干细胞的培养基组合物，其含有基本培养基(其中选自DMEM、α-MEM、IMDM、F12和DMEM/F12的培养基与成分确定的角质形成细胞-SFM混合)、L-抗坏血酸2-磷酸、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、胰岛素、N-乙酰基-L-半胱氨酸、氯化钙和氢化可的松。本专利技术还提供了培养间充质干细胞的方法，其中在所述培养基组合物中培养间充质干细胞。附图简述图1说明了在与作为准完全培养基的DMEM的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的形态学变化。图2说明了在与作为准完全培养基的α-MEM的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的形态学变化。图3说明了在与作为准完全培养基的IMDM的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的形态学变化。图4说明了在与作为准完全培养基的F12的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的形态学变化。图5说明了在与作为准完全培养基的DMEM/F12的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的形态学变化。图6说明了在与作为准完全培养基的DMEM的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的细胞产量(yield)。图7说明了在与作为准完全培养基的α-MEM的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的细胞产量。图8说明了在与作为准完全培养基的IMDM的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的细胞产量。图9说明了在与作为准完全培养基的F12的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的细胞产量。图10说明了在与作为准完全培养基的DMEM/F12的混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的细胞产量。图11说明了在与作为准完全培养基的DMEM的混合培养基中培养脂肪来源的间充质干细胞后细胞大小的变化。图12是显示每种混合培养基中脂肪来源的间充质干细胞的细胞产量的图，其中将细胞产量表示为相对于KSFM-P培养基中细胞产量的百分数。图13说明了确认混合培养基中干细胞表面标志物表达的结果。图14说明了确认混合培养基中干细胞表面标志物表达的结果。实施方式的详述除非另有定义，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的技术人员通常理解的相同的含义。通常，本说明书中使用的命名法和下文描述的实验方法是已知的并且通常用于本
在本公开内容中，确认当在将5％FBS添加到每种培养基的环境中培养脂肪来源的间充质干细胞时，其中已用于培养常规间充质干细胞的KSFM-P培养基(韩国专利注册号0679642)与可相对廉价地以准成品的形式购买的DMEM(达尔伯克改良伊戈尔培养基(Dulbeco'sModifiedEagle'sMedium))、IMDM(伊思考夫改良达尔伯克培养基(Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium))、α-MEM(伊戈尔培养基的α修饰)、F12(营养混合物F-12)和DMEM/F12(达尔伯克改良伊戈尔培养基:营养混合物F-12)培养基混合，干细胞特性几乎没有变化，并且在细胞有效增殖的同时可持续维持细胞的大小。因此，在一个方面，本公开内容涉及用于培养间充质干细胞的培养基组合物，其含有基本培养基(其中选自DMEM、α-MEM、IMDM、F12和DMEM/F12的培养基与成分确定的角质形成细胞-SFM混合)、L-抗坏血酸2-磷酸、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、胰岛素、N-乙酰基-L-半胱氨酸、氯化钙和氢化可的松。本专利技术中使用的术语“干细胞”指具有自我复制能力和分化成两个或更多个细胞的能力的细胞，且“成体干细胞”指其中随着生成过程的进行形成胚胎的每个器官的阶段中或成体阶段中显示的干细胞。本专利技术中使用的术语“间充质干细胞”指从人或哺乳动物组织分离的未分化干细胞，并且可源自各种组织。具体而言它们可为脐带来源的间充质干细胞、脐带血来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、肌肉来源的间充质干细胞、神经来源的间充质干细胞、皮肤来源的间充质干细胞、羊膜来源的间充质干细胞和胎盘来源的间充质干细胞。用于从各组织分离干细胞的技术在相关领域中是已知的。本专利技术中使用的术语“脂肪来源的干细胞”指从脂肪组织分离的未分化干细胞，并且其分离方法可为例如如下。也就是说，在培养悬浮于自吸脂获得的生理盐水中的含脂肪悬浮液后，将附着于培养容器如烧瓶的干细胞层用胰蛋白酶处理，然后收集，或者可通过以下方法分离脂肪来源的干细胞：通过用刮刀刮出而直接收集悬浮于少量生理盐水中的细胞。在本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于培养间充质干细胞的培养基组合物，其含有基本培养基、L‑抗坏血酸2‑磷酸、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(b‑FGF)、胰岛素、N‑乙酰基‑L‑半胱氨酸、氯化钙和氢化可的松，在所述基本培养基中选自DMEM、α‑MEM、IMDM、F12和DMEM/F12的培养基与成分确定的角质形成细胞‑SFM混合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.29 KR 10-2014-0148482;2014.12.26 KR 10-2011.一种用于培养间充质干细胞的培养基组合物，其含有基本培养基、L-抗坏血酸2-磷酸、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、胰岛素、N-乙酰基-L-半胱氨酸、氯化钙和氢化可的松，在所述基本培养基中选自DMEM、α-MEM、IMDM、F12和DMEM/F12的培养基与成分确定的角质形成细胞-SFM混合。2.权利要求1的培养基组合物，其中所述培养基组合物含有0.05至1mM抗坏血酸2-磷酸、2至20...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗廷灿，姜成根，金成民，李美淑，李珍花，权顺爱，
申请(专利权)人：R生物有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国,KR