一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法，包括：(1)采用基于抗体的负向分选法收集间充质干细胞；(2)采用无血清培养基扩增间充质干细胞。本发明专利技术优于常规的分离方法，在安全性和扩增能力方面，本发明专利技术提供的无血清培养基明显好于常规的有血清培养基，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法
本专利技术属于细胞培养与制备领域，特别涉及一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法。
技术介绍
间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs)是干细胞的一个分支，是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，广泛存在于多种组织中，如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织和脂肪组织等。间充质干细胞有三个显著的特点：1.体外的培养的间充质干细胞是贴壁生长的；2.间充质干细胞高表达CD73、CD90和CD105，不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR、CD14、CD19和CD11b等标志物；3.在合适的刺激因素下，间充质干细胞能分化成成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等多种组织的细胞。骨髓间充质干细胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells,BMMSCs)又称骨髓基质干细胞，是存在骨髓中的一类非造血干细胞。骨髓间充质干细胞具有间充质干细胞的普遍特性。骨髓间充质干细胞具有很强的增殖能力和多向分化能力，在合适的体内或者体外培养环境下可以分化成心肌细胞、脂肪细胞、肝脏细胞、神经细胞、软骨细胞和成骨细胞等多种类型的组织细胞。骨髓间充质干细胞来源广泛，取材容易，易于培养和扩增，而且多次传代后仍然保持其干细胞的特性。骨髓间充质干细胞低度表达MHC-Ⅰ分子，不表达MHC-Ⅱ分子和B7-1、B7-2等共刺激分子，具有很低的免疫原性，能逃脱宿主免疫系统的排除。除此之外，骨髓间充质干细胞还具有免疫调节和修复组织损伤的特殊功能。因此，骨髓间充质干细胞是一种具有巨大临床应用潜力的种子细胞；近年来国内外已经开展了利用骨髓间充质干细胞的多项临床试验，例如治疗心肌梗死、脊髓损伤、糖尿病、系统性红斑狼疮、肝硬化和膝骨关节炎等疾病。常规获取骨髓间充质干细胞的方法主要有以下几种：①贴壁分离法：利用MSCs贴壁的性质将其分离；②密度梯度离心法：利用Ficoll或者Percoll分离液将MSCs和其他细胞分离；③免疫磁珠法(正向分选)：利用能结合MSCs表面特有标志物的抗体分离MSCs。贴壁分离法和密度梯度离心法虽然操作简单，但是分离得到的间充质干细胞纯度不高，杂细胞会伴随着间充质干细胞一起增殖，从而逐渐降低间充质干细胞的纯度和生长速度。免疫磁珠法(正向分选)能得到纯度很高的间充质干细胞，但是抗体和磁珠会结合在间充质干细胞的表面，对细胞有损伤，也可能会非特异性激活目标细胞或者影响目标细胞在下游实验中的功能，而且正向分选的细胞也是不安全的。骨髓间充质干细胞的常规扩增方法是用基础培养基(例如DMEM、DMEM-F12、alpha-MEM)和10％浓度的胎牛血清进行培养。MSCs在有胎牛血清的条件下能正常的生长和传代，然而血清的成分比较复杂，既含有促使细胞生长的营养物质，又含有低水平的抑制细胞生长的物质。血清还有潜在的病毒和支原体污染，不同批次的血清性能差异明显。也可以用自体血清代替胎牛血清，但是大量扩增MSCs需要很多的自体血清，从而限制了自体血清在MSCs培养中的应用。尽管有很多研究报导用无血清培养基，但是MSCs在无血清条件下增殖较慢，并且存在分化能力丧失的可能。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法，该方法优于常规的分离方法，在安全性和扩增能力方面，本专利技术提供的无血清培养基明显好于常规的有血清培养基，具有良好的应用前景。本专利技术的一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法，包括：(1)采用基于抗体的负向分选法：在骨髓中加入抗体混合物使非目标细胞和红细胞交联，经密度梯度离心，从血浆层下层收集间充质干细胞；(2)采用无血清培养基扩增间充质干细胞，其中，无血清培养基添加以下组分：重组人胰岛素：1～10μg/ml；重组人表皮生长因子：10～50ng/ml；重组人碱性成纤维细胞生长因子：10～50ng/ml；重组人转化生长因子-β：1～50ng/ml；重组人血小板衍生生长因子-BB：10～50ng/ml；氢化可的松：0.5～10μg/ml；维生素C：10～100μg/ml；还原型谷胱甘肽：1～5mM；重组人转铁蛋白：0.5～10μg/ml；乙醇胺：1～10μg/mL；L-谷氨酰胺：1～10mM；辅酶A：1～50μg/ml；重组人凝血酶：1～10U/ml；庆大霉素：1～100μg/ml；亚硒酸钠：1～100ng/ml。在所述步骤(2)扩增间充质干细胞之前用1～10μg/mL的重组人纤连蛋白包被培养瓶。所述培养瓶在4℃的条件下包被过夜。所述步骤(2)中的无血清培养基为DMEM-F12。在所述步骤(2)扩增间充质干细胞之后细胞传代过程中使用TrypLETM消化细胞。本专利技术采用基于抗体的负向分选法(antibody-basednegativeisolation)从骨髓中分离间充质干细胞；这是一种高纯度分离骨髓间充质干细胞的方法，而且干细胞不会被任何抗体标记，保证了干细胞的天然性。本专利技术中用于培养干细胞的培养瓶需要用重组人纤连蛋白包被。在间充质干细胞扩增的过程中，用DMEM-F12作为基础培养基，在培养基中添加以下成分：重组人胰岛素、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、氢化可的松、维生素C、重组人转化生长因子-β、重组人血小板衍生生长因子-BB、还原型谷胱甘肽、重组人转铁蛋白、乙醇胺、L-谷氨酰胺、辅酶A、重组人凝血酶、庆大霉素、亚硒酸钠。该培养基成分明确，能显著的提高间充质干细胞的贴壁能力和增殖能力，有利于间充质干细胞在体外扩增和保持其干性(stemness)。本专利技术采用基于抗体的负向分选法(antibody-basednegativeisolation)从骨髓里面分离MSCs，其原理如下：使用一种抗体混合物(antibodycocktail)把骨髓中的MSCs和其他杂细胞分开。抗体混合物是一种四聚物抗体络合物，既能识别和结合红细胞表面的glycophorinA标志物，又能识别和结合不需要细胞表面的一些标志物(例如CD3,CD14,CD19,CD38,CD66b)。这样，骨髓中不需要的细胞(非目标细胞)和红细胞被结合在一起。当把被抗体标记的骨髓加在淋巴细胞分离液Ficoll上面并经过密度梯度离心后，不需要的细胞和红细胞聚集在离心管的底部形成沉淀，MSCs细胞被富集在血浆层和淋巴细胞分离液层之间，得到纯度很高的间充质干细胞。本专利技术提供的骨髓间充质干细胞无血清培养基含有多种生长因子和营养物质，这能促使间充质干细胞在无血清培养条件下正常的生长和代谢：纤连蛋白是一种细胞外基质蛋白，能介导细胞之间、细胞和细胞外基质的粘附。用纤连蛋白包被培养瓶能促使细胞更好的贴壁。本专利技术使用重组人纤连蛋白包被培养瓶。重组人胰岛素可以提高细胞的合成代谢能力，刺激细胞的生长。表皮生长因子是一种具有多种功能的生长因子，对细胞有强烈的促分裂作用。碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β和血小板衍生生长因子-BB都是具有促进细胞增殖和分裂的生长因子，这三种因子的组合已被证明能够显著促进间充质干细胞的增殖和增强干细胞的分化能力。氢化可的松是一种糖皮质激素，具有促进糖原异生和提高蛋白质分解代谢等作用。维生素C是一种抗氧化剂，能保护细胞免受自由基的威胁，而且维本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法，包括：(1)采用基于抗体的负向分选法：在骨髓中加入抗体混合物使非目标细胞和红细胞交联，经密度梯度离心，从血浆层下层收集间充质干细胞；(2)采用无血清培养基扩增间充质干细胞，其中，无血清培养基添加以下组分：重组人胰岛素：1～10μg/ml；重组人表皮生长因子：10～50ng/ml；重组人碱性成纤维细胞生长因子：10～50ng/ml；重组人转化生长因子‑β：1～50ng/ml；重组人血小板衍生生长因子‑BB：10～50ng/ml；氢化可的松：0.5～10μg/ml；维生素C：10～100μg/ml；还原型谷胱甘肽：1～5mM；重组人转铁蛋白：0.5～10μg/ml；乙醇胺：1～10μg/mL；L‑谷氨酰胺：1～10mM；辅酶A：1～50μg/ml；重组人凝血酶：1～10U/ml；庆大霉素：1～100μg/ml；亚硒酸钠：1～100ng/ml。

【技术特征摘要】
1.一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法，包括：(1)采用基于抗体的负向分选法：在骨髓中加入抗体混合物使非目标细胞和红细胞交联，经密度梯度离心，从血浆层下层收集间充质干细胞；(2)采用无血清培养基扩增间充质干细胞，其中，无血清培养基添加以下组分：重组人胰岛素：1～10μg/ml；重组人表皮生长因子：10～50ng/ml；重组人碱性成纤维细胞生长因子：10～50ng/ml；重组人转化生长因子-β：1～50ng/ml；重组人血小板衍生生长因子-BB：10～50ng/ml；氢化可的松：0.5～10μg/ml；维生素C：10～100μg/ml；还原型谷胱甘肽：1～5mM；重组人转铁蛋白：0.5～10μg/ml；乙醇胺：1～10μg/mL；L-谷氨酰胺：1～10mM；辅酶A：1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新峰，
申请(专利权)人：上海莱馥医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31