一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建及其表达方法技术

本发明专利技术公开一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建方法，属于基因工程领域，将奶牛LYZ基因mRNA序列翻译为cDNA序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，采用双酶切获得目的片段、pET32a载体片段，将目的片段和pET32a载体片段连接，构建LYZ‑pET32T原核表达载体。本发明专利技术通过人工设计并合成LYZ基因CDS序列，将其克隆至表达载体pET32T并转化大肠杆菌TOP10，筛选阳性菌株，经IPTG诱导，初步纯化表达产物，并对其进行SDS‑PAGE分析。本发明专利技术成功的构建原核表达载体LYZ‑pET32T，纯化分离得到奶牛溶菌酶蛋白，为后续研究与应用奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建及其表达方法
本专利技术涉及一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建及其表达方法，属于基因工程领域。
技术介绍
溶菌酶作为哺乳动物机体防御因子的重要成员，因其具有抗菌、消炎、组织修复以及提高免疫力等多方面活性，同时又是一种天然、无毒的蛋白质，只作用于细菌细胞壁，而对动物机体无害，如果能体外构建溶菌酶的表达载体并高效表达，将具有深远的生物学和经济价值。溶菌酶(Lysozyme)全称1,4-β-N-溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，能够特异水解细菌细胞壁中肽聚糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1，4-糖苷键，是一种具有抗菌、溶菌活性的固有免疫效应分子。目前已知在高等反刍动物(如牛、羊和鹿等)基因组中存在大概10种溶菌酶相似基因。然而研究发现，反刍动物虽然有众多溶菌酶基因，但相对于其他动物机体缺乏溶菌酶，此外，不同组织溶菌酶表达差异巨大，牛肾、血液、泪液、乳汁中溶菌酶表达水平低于大多数动物，牛溶菌酶在乳腺中水平较低，仅为0.05～0.13mg/L，相比之下，人乳腺溶菌酶表达量可比其高2000～4000倍。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题，本专利技术提供一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建及其表达方法，选择原核大肠杆菌表达系统，对奶牛乳腺溶菌酶基因进行克隆表达，获得奶牛溶菌酶的高效表达载体，为研究奶牛溶菌酶的生物学活性奠定基础。为了实现上述目的，本专利技术采用的一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建方法，将奶牛LYZ基因mRNA序列翻译为cDNA序列，其序列如SEQIDNO.1所示，采用双酶切获得目的片段、pET32a载体片段，将目的片段和pET32a载体片段连接，构建LYZ-pET32T原核表达载体。作为改进，构建方法具体包括以下步骤：1)LYZ基因cDNA链的合成：将奶牛LYZ基因mRNA序列翻译为cDNA序列，其中cDNA序列中的CCATGG为引入的NcoI酶切位点、CTCGAG为引入的XhoI酶切位点；2)酶切反应：采用双酶切获得目的片段，胶回收获得载体片段和目标片段；pET32a载体采用NcoI、XhoI双酶切线性化后通过胶回收获得载体片段；3)连接反应：将步骤2)中回收纯化好的目的DNA片段和载体片段，用T4连接酶进行连接，构建LYZ-pET32T原核表达载体。一种LYZ-pET32T原核表达载体，采用上述任一项所述方法构建。一种采用上述任一项所述方法构建的LYZ-pET32T原核表达载体的表达方法，挑取单克隆接种至新鲜的LB液体培养基于37℃培养4小时，OD600为0.6，加入终浓度为0.6mM的IPTG诱导pET32T-LYZ的表达。作为改进，所述LB液体培养基含50mg/l氨苄。本专利技术通过人工设计并合成LYZ基因CDS序列，将其克隆至表达载体pET32T并转化大肠杆菌TOP10，筛选阳性菌株，经IPTG诱导，初步纯化表达产物，并对其进行SDS-PAGE分析。重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定结果正确，表达产物经SDS-PAGE检测，分子量约为33KD，与目标蛋白质一致。本专利技术成功的构建原核表达载体LYZ-pET32T，在体外诱导分泌获得了溶菌酶蛋白，可将其应用于饲料生产与家畜饲养中，配合其他添加剂可以延长饲料的贮存期，同时又可预防和治疗动物消化道腹泻等疾病；此外还可作为新药物用于奶牛乳房炎的治疗，并可提高动物产品质量安全和公共卫生水平，保护人体健康。有效降低奶牛乳房炎给养殖业带来的风险和经济损失，促进养殖企业及养殖户增收。提高动物及其产品的国际竞争力，带动相关产业，促进经济发展。附图说明图1为本专利技术扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；M：DL5000bpDNAMarker；1-6：不同的克隆；图2为本专利技术LYZ-pET32T载体测序结果；(a)中517bp碱基左侧为载体序列，右侧为LYZ序列；(b)中869bp碱基左侧为LYZ序列，右侧为载体序列；图3为本专利技术LYZ-pET32T限制性酶切验证结果，图中M：DL5000bpDNAMarke；1：酶切前质粒；2：双酶切质粒；图4为本专利技术表达及纯化产物的SDS-PAGE分析，图中1：未诱导；2：菌株1诱导后；3：菌株2诱导后；M：中分子量蛋白Marker。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限制本专利技术的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。实施例11.1主要实验材料限制性内切酶NcoI、XhoI购自Fermentas公司，表达载体pET32T，T4DNALigase，2×TaqMasterMix，PCR产物回收试剂盒，胶回收试剂盒，DL5000bpMarker，大肠杆菌TOP10菌株，中分子量蛋白Marker，6×His标签蛋白纯化试剂盒(Ni-IDA)，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自ProbeGene公司，寡核苷酸合成以及DNA测序服务由上海生物工程有限公司提供，SDS，异丙基硫代半乳糖苷-诱导剂(IPTG)购自Amersco公司，Acr、Bis、Tris购自Sigma公司，TEMED购自BIO-RAD公司。其它常规试剂从国药集团采购。1.2构建方法1.2.1LYZ基因cDNA链的合成根据已知的奶牛LYZ基因mRNA序列(NCBIReferenceSequence:NM_001077829.1)，用PrimerPremier6.0软件将其翻译为cDNA序列，其序列如SEQIDNO.1所示，并由上海生工公司合成。序列如下：CCATGGCTAAGAAATTTCAGCGTTGTGAGCTGGCGCGGACGCTGAAAAAGCTGGGGCTGGACGGCTACCGGGGCGTGAGTTTAGCAAACTGGGTTTGTCTGGCACGTTGGGAGAGTAATTATAATACGAGAGCAACAAATTACAACCGTGGTGATAAAAGCACAGATTATGGTATTTTTCAGATCAATAGCCGTTGGTGGTGTAATGATGGGAAAACACCGAAAGCAGTGAATGCATGTCGGATTCCGTGTAGCGCACTGCTGAAAGATGATATCACCCAGGCGGTTGCATGTGCGAAGCGCGTTGTGAGAGATCCCCAGGGGATTAAAGCATGGGTTGCATGGCGTAACAAATGTCAAAATAGAGACCTGAGAAGCTACGTGCAGGGGTGTCGGGTTTAACTCGAG。其中CCATGG为引入的NcoI酶切位点、CTCGAG为引入的XhoI酶切位点。1.2.2酶切反应采用双酶切获得目的片段和载体片段，以下体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h后，胶回收获得载体片段和目标片段；酶切反应体系如下：目的片段酶切体系50μL：目的片段1μg，10×FDBuffer5μL，NcoI1μL(10u/μL)，XhoI1μL(10u/μL)，加ddH2O至50μL；载体的酶切体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建方法，其特征在于，将奶牛LYZ基因mRNA序列翻译为cDNA序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，采用双酶切获得目的片段、pET32a载体片段，将目的片段和pET32a载体片段连接，构建LYZ‑pET32T原核表达载体。

【技术特征摘要】
1.一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建方法，其特征在于，将奶牛LYZ基因mRNA序列翻译为cDNA序列，其序列如SEQIDNO.1所示，采用双酶切获得目的片段、pET32a载体片段，将目的片段和pET32a载体片段连接，构建LYZ-pET32T原核表达载体。2.根据权利要求1所述的一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)LYZ基因cDNA链的合成：将奶牛LYZ基因mRNA序列翻译为cDNA序列，其中cDNA序列中的CCATGG为引入的NcoI酶切位点、CTCGAG为引入的XhoI酶切位点；2)酶切反应：采用双酶切获得目的片段，胶回收获得载体片段和目标片段；pET32a载体采用NcoI...

【专利技术属性】
技术研发人员：李云龙，张海涛，顾开朗，高峰，孙朋，陈仁金，
申请(专利权)人：徐州生物工程职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32