一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建及其表达方法技术

本发明专利技术公开一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建方法，属于基因工程领域，将奶牛LYZ基因mRNA序列翻译为cDNA序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，采用双酶切获得目的片段、pET32a载体片段，将目的片段和pET32a载体片段连接，构建LYZ‑pET32T原核表达载体。本发明专利技术通过人工设计并合成LYZ基因CDS序列，将其克隆至表达载体pET32T并转化大肠杆菌TOP10，筛选阳性菌株，经IPTG诱导，初步纯化表达产物，并对其进行SDS‑PAGE分析。本发明专利技术成功的构建原核表达载体LYZ‑pET32T，纯化分离得到奶牛溶菌酶蛋白，为后续研究与应用奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建及其表达方法
本专利技术涉及一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建及其表达方法，属于基因工程领域。
技术介绍
溶菌酶作为哺乳动物机体防御因子的重要成员，因其具有抗菌、消炎、组织修复以及提高免疫力等多方面活性，同时又是一种天然、无毒的蛋白质，只作用于细菌细胞壁，而对动物机体无害，如果能体外构建溶菌酶的表达载体并高效表达，将具有深远的生物学和经济价值。溶菌酶(Lysozyme)全称1,4-β-N-溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，能够特异水解细菌细胞壁中肽聚糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1，4-糖苷键，是一种具有抗菌、溶菌活性的固有免疫效应分子。目前已知在高等反刍动物(如牛、羊和鹿等)基因组中存在大概10种溶菌酶相似基因。然而研究发现，反刍动物虽然有众多溶菌酶基因，但相对于其他动物机体缺乏溶菌酶，此外，不同组织溶菌酶表达差异巨大，牛肾、血液、泪液、乳汁中溶菌酶表达水平低于大多数动物，牛溶菌酶在乳腺中水平较低，仅为0.05～0.13mg/L，相比之下，人乳腺溶菌酶表达量可比其高2000～4000倍。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建方法，其特征在于，将奶牛LYZ基因mRNA序列翻译为cDNA序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，采用双酶切获得目的片段、pET32a载体片段，将目的片段和pET32a载体片段连接，构建LYZ‑pET32T原核表达载体。

【技术特征摘要】
1.一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建方法，其特征在于，将奶牛LYZ基因mRNA序列翻译为cDNA序列，其序列如SEQIDNO.1所示，采用双酶切获得目的片段、pET32a载体片段，将目的片段和pET32a载体片段连接，构建LYZ-pET32T原核表达载体。2.根据权利要求1所述的一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)LYZ基因cDNA链的合成：将奶牛LYZ基因mRNA序列翻译为cDNA序列，其中cDNA序列中的CCATGG为引入的NcoI酶切位点、CTCGAG为引入的XhoI酶切位点；2)酶切反应：采用双酶切获得目的片段，胶回收获得载体片段和目标片段；pET32a载体采用NcoI...

【专利技术属性】
技术研发人员：李云龙，张海涛，顾开朗，高峰，孙朋，陈仁金，
申请(专利权)人：徐州生物工程职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32