一种基于信息素结合蛋白的茶尺蠖性信息素的筛选和鉴定方法技术

一种基于茶尺蠖信息素结合蛋白的性信息素筛选和鉴定方法，属于生物工程技术领域。其包括：收集茶尺蠖雄蛾触角总RNA；通过RT‑PCR获得茶尺蠖信息素结合蛋白的全长；构建茶尺蠖信息素结合蛋白的原核表达载体；通过IPTG诱导茶尺蠖重组信息素结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；通过竞争性荧光结合方法获得茶尺蠖重组信息素结合蛋白与茶树叶片气味挥发物以及候选茶尺蠖性信息素的结合反应谱，能使1‑NPN的相对荧光强度降低至50%以下，且结合常数为20μmol/L以下的测试配基确定为茶尺蠖性信息素。本发明专利技术为茶尺蠖植物源气味信息引诱剂配方的筛选和鉴定和设计提供了新的策略。

【技术实现步骤摘要】
一种基于信息素结合蛋白的茶尺蠖性信息素的筛选和鉴定方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种基于信息素结合蛋白的茶尺蠖性信息素的筛选和鉴定方法。
技术介绍
茶尺蠖EctropisobliquaProut，属鳞翅目，尺蛾科，是一种广泛分布于长江流域各产茶省的重大茶树害虫，由于其喜食茶树叶片，且发生代数多，繁殖快，因其具有暴食性，严重时可将茶树叶片全部吃光，造成茶业减产甚至绝收。目前防控茶尺蠖主要依赖化学农药防治和性信息素诱杀手段，然而农药使用极易引起茶叶商品中的农药残留问题，而性信息素诱杀主要问题是茶尺蠖性信息素的鉴定问题。茶尺蠖性信息素通过依赖于化学分析仪器分析手段来筛选和鉴定，然而一方面茶尺蠖性腺的挥发物成分复杂，另一方面该法需要配备高昂的仪器设备以及丰富的分析化学经验技术。因此，需要利用其它思路来进一步筛选和鉴定茶尺蠖性信息素。在鳞翅目中，雄虫的触角感器淋巴液里存在着大量的信息结合蛋白，而这种蛋白与其雌蛾释放的性信息素能够特异结合。因此，利用茶尺蠖信息素结合蛋白与性信息素的特异结合关系，为能进一步筛选茶尺蠖性信息素提供有利帮助。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种基于茶尺蠖信息素结合蛋白的性信息素的筛选和鉴定方法的技术方案。所述的一种基于茶尺蠖信息素结合蛋白的性信息素的筛选和鉴定方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）收集茶尺蠖雄虫触角总RNA；2）通过RT-PCR获得茶尺蠖信息素结合蛋白的全长；3）构建茶尺蠖信息素结合蛋白的原核表达载体；4）通过IPTG诱导茶尺蠖重组信息素结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；5）通过竞争性荧光结合方法获得茶尺蠖重组信息素结合蛋白与包括茶树叶片气味挥发物在内的化学信息物质的结合反应谱，能使1-NPN的相对荧光强度降低至50%以下，且结合常数为2～16μmol/L的候选化学信息物质确定为茶尺蠖性信息素。所述的一种基于茶尺蠖信息素结合蛋白的性信息素的筛选和鉴定方法，其特征在于所述的步骤4）中IPTG诱导茶尺蠖重组信息素结合蛋白表达的诱导条件为：IPTG浓度为1mmol/L，温度为37℃，诱导转速为200rpm，诱导时间为6h。所述的一种基于茶尺蠖信息素结合蛋白的性信息素的筛选和鉴定方法，其特征在于所述的步骤5）中竞争性荧光结合方法获得茶尺蠖重组信息素结合蛋白与包括茶树叶片气味挥发物在内的化学信息物质的结合反应谱的步骤如下：1）荧光配基1-NPN与茶尺蠖重组信息素结合蛋白的结合在290nm激发波长下，向1μmol/L的茶尺蠖重组信息素结合蛋白中逐次加入1mmol/L的1-NPN，充分混匀；2）配基结合选取包括茶树叶片气味挥发物在内的化学信息物质和1-NPN进行竞争结合茶尺蠖重组信息素结合蛋白，能使1-NPN的相对荧光强度降低至50%以下，且结合常数为2～16μmol/L的所有待测配基中化学物质确定为茶尺蠖性信息素。本专利技术从茶尺蠖嗅觉生理的模式出发，通过分子生物学技术克隆了其信息素结合蛋白全长基因，并通过原核表达技术获得了编码该基因的重组蛋白，最后通过生物化学结合技术探讨了其与包括茶树叶片气味挥发物在内的化学信息物质挥发物的亲和力。本专利技术为茶尺蠖植物源气味信息引诱剂配方的筛选和鉴定和设计提供了新的策略。附图说明图1为茶尺蠖EoblPBP2基因的克隆；图2为重组茶尺蠖信息素结合蛋白EoblPBP2的表达和分离纯化；图3A、3B和3C为候选气味信息与荧光配基1-NPN和重组EoblPBP2蛋白的竞争结合；图4为候选气味引诱剂对茶尺蠖的触角反应电位。具体实施方式以下结合实施例来进一步说明本专利技术。实施例11）收集茶尺蠖触角总RNA的具体步骤；材料：茶尺蠖为杭州茶园捕捉幼虫，在实验室人工饲养至成虫后供实验用。幼虫饲养条件为：温度26±1℃，L:D=12:12，RH为70%～80%。利用TRIzol法提取茶尺蠖成虫触角的总RNA，并利用Super-Script™IIReverseTranscriptaseSystem(Takara)反转录获得cDNA第一链。2）通过RT-PCR获得茶尺蠖信息素结合蛋白的全长的具体步骤；①以茶尺蠖雄虫触角cDNA为模板，设计上游引物：5′-CCGGATCCATGACTAAGCTAAAGGAACTAC-3′；下游引物：5′-TTCTCGAGCTAAGCTTCGGCCAAGACTTCAG-3′进行PBP2的基因扩增。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。②茶尺蠖PBP2cDNA的扩增、克隆和测序。以反转录酶合成cDNA第一链为模板，用引物对其进行PCR扩增。经过对PCR条件进行优化，最终确定6个基因的PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃30s，62.1℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。将目的分子量位置的明亮条带割胶回收，并与pMD18-T克隆载体在16℃的反应条件下连接过夜，经菌液PCR鉴定后送测序公司进行测序。如图1所示。3）构建茶尺蠖信息素结合蛋白的原核表达载体的具体步骤。测序成功的pMD18-T/EoblPBP2质粒和表达载体pET-32a(+)经限制性核酸内切酶BamHI、XhoI进行双酶切，37℃反应1h。将载体片段与目的片段以1:3的摩尔比进行16℃连接30min。将连接产物全部转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，鉴定为阳性的克隆再送测序公司进行测序。4）通过IPTG诱导茶尺蠖重组信息素结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化的具体步骤；①重组茶尺蠖PBP2蛋白的诱导、表达和表达形式的确定测序正确后，将构建好的pET32-EoblPBP2表达质粒导入大肠杆菌E.coli感受态BL21中，在氨苄抗性的LB培养基平板中挑选单菌落，PCR验证。挑选阳性克隆菌按1:100(V/W)的比例接种于10mL氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床过夜培养。翌日，以1:50(V/W)的比例将过夜活化的菌液接种至200mLLB培养基中（含50μg/ml氨苄青霉素），摇床震荡培养3h左右利用紫外分光光度计检测OD值。当OD值达到0.8时，取出1mL菌液作为对照，向剩余的菌液中加入IPTG使其终浓度达到1mmol/L，30℃200rpm摇床培养5h。10000rpm离心6min收集菌体。超声波细胞破碎仪破碎细胞15min后高速离心。通过12%SDS-PAGE凝胶电泳检测以确定重组蛋白表达以及形式。②重组茶尺蠖PBP2蛋白的分离纯化表达形式确定后，选取上清分离重组蛋白。将上清液全部移至镍NTA琼脂糖凝胶柱，用含有不同浓度咪唑的上清缓冲液洗脱蛋白。将最终得到的多管洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳检测以确定目的蛋白所处的洗脱液管。将含有重组PBP5蛋白的洗脱液转移至透析袋内，在PBS缓冲液(pH7.4)中4℃透析72hr。最终得到的重组蛋白利用酶标仪测定浓度。5）重组茶尺蠖信息素结合蛋白EoblPBP2的表达和分离纯化结果由图2所示，M为蛋白分子量标准；其中1~2为EoblPBP2的诱导表达，其中1为未诱导（阴性）对照组，2为诱导（阳性）表达产物；3~4为细菌破碎后的表达形式的确定，其中3为上清蛋白，4为包涵体蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于茶尺蠖信息素结合蛋白的性信息素筛选和鉴定方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）收集茶尺蠖雄蛾触角总RNA；2）通过RT‑PCR获得茶尺蠖信息素结合蛋白的全长；3）构建茶尺蠖信息素结合蛋白的原核表达载体；4）通过IPTG诱导茶尺蠖重组信息素结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；5）通过竞争性荧光结合方法获得茶尺蠖重组信息素结合蛋白与茶树叶片气味挥发物以及候选茶尺蠖性信息素的结合反应谱，能使1‑NPN的相对荧光强度降低至50 %以下，且结合常数为20 μmol/L以下的测试配基确定为茶尺蠖性信息素。

【技术特征摘要】
1.一种基于茶尺蠖信息素结合蛋白的性信息素筛选和鉴定方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）收集茶尺蠖雄蛾触角总RNA；2）通过RT-PCR获得茶尺蠖信息素结合蛋白的全长；3）构建茶尺蠖信息素结合蛋白的原核表达载体；4）通过IPTG诱导茶尺蠖重组信息素结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；5）通过竞争性荧光结合方法获得茶尺蠖重组信息素结合蛋白与茶树叶片气味挥发物以及候选茶尺蠖性信息素的结合反应谱，能使1-NPN的相对荧光强度降低至50%以下，且结合常数为20μmol/L以下的测试配基确定为茶尺蠖性信息素。2.如权利要求1所述的一种基于信息素结合蛋白的茶尺蠖性信息素的筛选和鉴定方法，其特征在于所述的步骤4）中IPTG诱导茶尺蠖重组信息素结合蛋白表达的诱导条件为：IPT...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红亮，冯一璐，赵磊，吴帆，傅晓斌，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33