一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用，构建方法为：(1)以大肠杆菌△A为出发菌株，通过基因敲除或基因沉默的方法使大肠杆菌△A染色体上的galE，galT和ugd基因不表达，得到大肠杆菌菌株BMGU；(2)向大肠杆菌菌株BMGU中导入ARO10，UGT73B6

Recombinant Escherichia coli producing salidroside and its construction method and Application

The invention discloses a recombinant Escherichia coli for production of salidroside and its construction method and application of construction method is as follows: (1) in Escherichia coli A strain by gene knock out or gene silencing to Escherichia coli A on chromosome galE, the expression of galT and ugd genes derived from Escherichia coli strain BMGU; (2) into Escherichia coli strain BMGU ARO10 UGT73B6

【技术实现步骤摘要】
一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用
本专利技术属于生物工程
，具体地，涉及一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用。
技术介绍
红景天是生长在高寒无污染地带的珍稀野生植物，是我国藏族人民的习用药物，至今已有1000多年的应用历史，具有刺激神经系统、增加工作效率、消除疲劳和预防高山症等作用。除此之外，红景天还具有保护心脑血管，神经细胞以及抗肿瘤抗辐射等功能。红景天的主要药用活性成分是红景天苷及其苷元酪醇。近年来，以红景天苷作为主要原料生产的药剂、饮料、食品以及化妆品等产品种类越来越多，其苷元酪醇是一种具有重要工业价值的酚类化合物，酪醇及其衍生物是多种有机化合物的合成前体。人们对红景天苷及其苷元酪醇的关注程度不断提高。除红景天苷和酪醇外，红景天植物中还含有其它一些化学物质，例如，淫羊藿次苷D2。红景天苷(Salidroside)具有以下特征：化学名称为2‐(4‐hydroxyphenyl)ethyl‐β‐D‐glucopyranoside，分子式为C14H20O7，分子量为300.304，CAS号为10338‐51‐9，结构式为淫羊藿次苷D2(IcarisideD2)具有以下特征：化学名称为p‐(2‐hydroxyethyl)‐phenol‐D‐pyranoglucoside，分子式为C14H20O7，分子量为300.31，CAS号为38954‐02‐8，结构式为其苷元酪醇(Tyrosol)具有以下特征：化学名称为4‐(2‐Hydroxyethyl)phenol，分子式为C8H10O2，分子量为138.164，CAS号为501‐94‐0，结构式为目前，红景天苷的生产主要是对红景天植株进行化学提取。野生红景天生长条件恶劣，植被资源稀有，而且红景天苷的量很低，如现在最常用的高山红景天和大花红景天，其植株中红景天苷的量只有0.5％‐0.8％。人工栽培的红景天成本高而有效成分量低，达不到市场要求的标准。因而植物提取正面临严峻的现实。除植物提取外，化学合成、微生物转化及组织培养生产红景天苷也是研究热点。明海泉以酪醇和溴代四乙酰葡萄糖为原料，以Ag2CO3为催化剂，成功合成了红景天苷(明海泉，红景天苷合成及药理作用，药学通讯，1986,21(6):373)。王梦亮等以D‐葡萄糖和酪醇为底物，探索出了一种借助于微生物合成红景天苷的方法(王梦亮，张芳，刘滇生，微生物催化D‐葡萄糖与酪醇葡糖基转移合成红景天苷的初步研究，催化学报，2006,27(3):233‐236)。在采用组织培养方式进行红景天苷的生物合成方面，研究成果最为成熟的是Wu等用致密愈伤组织体系进行的红景天苷高产出率培养条件的研究。从高山红景天的根、茎、叶、子叶等分离体得到的相应的几种愈伤组织，并对其生长速度、红景天苷量和培养繁殖条件进行筛选，确定了生成高产出率红景天苷的最佳条件，红景天苷最高收获率可达到干重57.72mg/g，为野生植株的5～10倍(WuS,ZuY,WuMHighyieldproductionofsalidrosideinthesuspensioncultureofRhodiolasachalinensis[J]JBiotechnol,2003,106(1):331)。张罗红等采用硅胶柱色谱与制备型高效液相色谱，首次从红景天苷原料药中分离出了淫羊藿次苷D2，是酪醇酚羟基糖基化的产物(张罗红，彭艳，都述虎，红景天苷原料药中有关物质的分离与结构鉴定，中药与临床，2010,1(3):21‐23)。但是化学合成工艺过程长不易操作控制，成本高，难以实现产业化；微生物转化效率较低，需要添加外源底物；植物组织培养反应周期长，效价较低。本专利技术的专利技术人提交的名为“一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用”(申请号201310133238.7)的专利申请中，在大肠杆菌(Escherichiacoli)中构建了一条新的不同于植物的酪醇生物合成通路，该途径利用大肠杆菌本身合成的4‐羟苯基丙酮酸，引入酵母菌的4‐羟苯基丙酮酸脱羧酶(ARO10)将其转化为4‐羟苯基乙醛(4HPAA)，4HPAA脱氢生成酪醇。本专利技术的专利技术人提交的专利申请号为：201410115011.4专利技术名称为：“一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌及其应用”的专利申请中，在大肠杆菌中构建了一条新的不同于植物的酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2生物合成通路，通过调控大肠杆菌酪氨酸代谢通路实现酪醇的高产：通过对aroG和tyrA基因进行点突变以分别获得tyrA*基因，aroG*基因；在敲除feaB基因基础上，进一步敲除tyrR，pykA，pykF，pheA基因；通过导入含有tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB，aroD和aroE基因的载体，使这些基因进行过表达；调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，来增强酪醇的合成，构建高产红景天苷苷元酪醇的大肠杆菌表达菌株；然后通过在大肠杆菌表达菌株中表达UDP葡萄糖基转移酶UGT73B6，异源合成红景天苷及淫羊藿次苷D2，从而实现了红景天苷及淫羊藿次苷D2在大肠杆菌中的生物全合成。酪醇产量达到600mg/L，红景天苷的产量可达50mg/L，同时，该菌株还可以合成淫羊藿次苷D2，产量达40mg/L。本专利技术的专利技术人提交的专利申请号为：201510160496.3专利技术名称为：“催化天麻素或红景天苷合成的糖基转移酶及编码该酶的基因及应用”的专利申请中，提供了一种催化红景天苷合成的糖基转移酶UGT73B6及其突变体UGT73B6MK，能够显著提高红景天苷的产量。上述专利技术已经在大肠杆菌中实现了从头合成红景天苷，但产量较低，因此，提高红景天苷的产量具有重要的科研价值及社会效益。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种能高效率地生产红景天苷的重组大肠杆菌。本专利技术的第二个目的是提供一种生产红景天苷的重组大肠杆菌的构建方法。本专利技术的第三个目的是提供一种生产红景天苷的重组大肠杆菌的应用。本专利技术的技术方案概述如下：一种生产红景天苷的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：(1)以大肠杆菌△A为出发菌株，通过基因敲除或基因沉默的方法使大肠杆菌△A染色体上的galE，galT和ugd基因不表达，得到大肠杆菌菌株BMGU；(2)向大肠杆菌菌株BMGU中导入ARO10，UGT73B6MK，pgm，galU和T7Polymerase基因，使ARO10，UGT73B6MK，pgm，galU和T7Polymerase基因过表达，异源合成红景天苷，得到一种生产红景天苷的重组大肠杆菌BMGU‐1。上述方法构建的生产红景天苷的重组大肠杆菌BMGU-1。上述生产红景天苷的重组大肠杆菌在发酵生产酪醇、红景天苷和淫羊藿次苷D2的用途。本专利技术通过引入高效UDP葡萄糖基转移酶突变体UGT73B6MK，并对葡萄糖代谢途径进行优化，显著提高了红景天苷的产量。附图说明图1为本专利技术的在大肠杆菌表达菌株中生物合成酪醇、红景天苷及淫羊藿次苷D2的途径示意图；图2为菌株BMGU‐1(pETDuet‐ARO10‐UGT73B6MK&pBbA5c‐T7Pol‐lacpgm‐lacgalU)的摇瓶小摇发酵产物以及酪醇和红景天苷标准品的HPLC结果。其中，1是红景本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产红景天苷的重组大肠杆菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)以大肠杆菌△A为出发菌株，通过基因敲除或基因沉默的方法使大肠杆菌△A染色体上的galE，galT和ugd基因不表达，得到大肠杆菌菌株BMGU；(2)向大肠杆菌菌株BMGU中导入ARO10，UGT73B6

【技术特征摘要】
1.一种生产红景天苷的重组大肠杆菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)以大肠杆菌△A为出发菌株，通过基因敲除或基因沉默的方法使大肠杆菌△A染色体上的galE，galT和ugd基因不表达，得到大肠杆菌菌株BMGU；(2)向大肠杆菌菌株BMGU中导入ARO10，UGT73B6MK，pgm，galU和T7Po...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘涛，毕慧萍，庄以彬，殷华，孙雪，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12