一种体外表达大腹园蛛牵引丝蛋白的新方法技术

本发明专利技术公开了一种体外表达大腹园蛛牵引丝蛋白的新方法。本发明专利技术首次构建出16倍体的拟大腹园蛛牵引丝蛋白基因的表达载体，并在大肠杆菌Rosetta（DE3）细胞株中成功表达，同时优化了表达体系，整个流程简便高效。本发明专利技术首次成功实现了大腹园蛛高分子牵引丝蛋白的体外表达，为今后利用高新技术大量生产大腹园蛛高分子牵引丝蛋白提供可靠的方法和途径，服务于社会的实际需求，具有很好的应用前景。

A new method of in vitro expression of Araneus Ventricosus Dragline Silk Protein

The present invention discloses a new method for the in vitro expression of Araneus Ventricosus Dragline Silk protein. This invention is the first to construct quasi araneusventricosusspider traction expression vector of silk protein gene was 16 times as much as that in the Escherichia coli Rosetta (DE3) successfully expressed in cell lines, while optimizing the expression system, the whole process is simple and efficient. The expression of this invention is the first successful implementation of Araneus Ventricosus Dragline Silk protein polymer in vitro, for the future use of high technology to produce large amounts of araneusventricosusspider polymers provides the method and way of reliable dragline silk protein, the actual demand of service to the society, has good application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种体外表达大腹园蛛牵引丝蛋白的新方法
本专利技术属于基因工程
更具体地，涉及一种人工合成大腹园蛛牵引丝蛋白的表达载体及体外表达方法。
技术介绍
蜘蛛丝具有较高的强度和弹性，且耐腐蚀和不会污染环境等许多优良的性能，因此蜘蛛丝在各行各业中具有广泛的应用。然而蜘蛛是捕食性动物，且伴有同类相食现象，很难高密度饲养，加上蜘蛛的产丝量较少，难以满足生产应用中的广泛需求。随着生物技术的不断发展，世界上众多科学家尝试利用基因工程的方法来生产蜘蛛丝蛋白。目前国际上已成功构建出络新妇属蜘蛛(Nephliaclavipe)牵引丝蛋白基因序列，并已分别在大肠杆菌、酵母等不同生物中试验表达效果。大腹园蛛为我国常见蛛种，其所结的蛛网较大，并且蜘蛛丝性能与同类相比更加优良。本专利技术人团队前期研究获得了一种人工构建的大腹园蛛牵引丝蛋白基因（专利技术专利申请201611261291.5），我们选取大腹园蛛牵引丝蛋白cDNA序列中最有代表性的核心重复序列108bp为单体，成功构建出16倍体的拟大腹园蛛牵引丝蛋白基因的编码序列，长度共1836bp；并进行了初步的原核表达显示，能够成功表达出拟大腹园蛛牵引丝蛋白，但表达有困难，表达量很低，无法实现工业上的大批量生产。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有大腹园蛛牵引丝蛋白表达技术的缺陷和不足，构建了一种大腹园蛛牵引丝蛋白的表达载体，主要涉及大腹园蛛牵引丝蛋白基因的表达载体构建体系，表达体系的构建及优化，以及表达蛋白的鉴定等。本专利技术的目的是提供一种大腹园蛛牵引丝蛋白的表达载体。本专利技术另一目的是提供一种体外表达大腹园蛛牵引丝蛋白的新方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术提供了一种大腹园蛛牵引丝蛋白的表达载体，构建方法如下：S1.将16倍串联体的拟大腹园蛛牵引丝蛋白基因的克隆载体以NheI和HindⅢ两种限制性内切酶进行酶切，回收目的基因片段；S2.将pET-28a-c(+)质粒用限制性内切酶SpeI和HindIII进行双酶切，回收线性载体；S3.将回收的目的基因片段和线性载体进行连接；S4.将连接产物转化大肠杆菌Rosetta（DE3）表达型感受态细胞；S5.转化后的细胞在含Kan和氯霉素的选择性培养基上进行铺板培养，筛选阳性重组子。其中，优选地，步骤S1和S2所述酶切的反应体系如下：质粒2μg10×Quickcutbuffer5μL内切酶各1μLddH2O补足50μL。优选地，步骤S1和S2所述酶切的反应步骤为：上述酶切反应体系轻轻混匀后瞬时离心，37℃保温2h。优选地，步骤S3所述连接的反应体系如下：目的基因片段6μL线性载体2μL10×T4ligasebuffer1μLT4连接酶1μL。优选地，步骤S3所述连接的反应条件为：16℃下8h。本专利技术还提供了一种体外表达大腹园蛛牵引丝蛋白的新方法，包括如下步骤：S1.挑选权利要求1所述表达载体的阳性单克隆至LB液体培养基中，过夜培养；S2.吸取过夜培养的菌液至LB液体培养基中，培养至OD值达到0.5～0.7，加入IPTG至终浓度为4～8mMmM，诱导表达4.5～5.5h；S3.收集诱导表达的菌液进行离心收集菌体，然后进行可溶性蛋白抽提。其中，优选地，步骤S1和S2所述LB液体培养基中均含抗生素Kan和氯霉素。优选地，步骤S1所述过夜培养的条件为37℃、180rpm下培养8～12h。优选地，步骤S2所述培养的条件为37℃、180rpm下培养至OD值达到0.6。优选地，步骤S2所述IPTG的终浓度为6～7.5mM。更优选地，步骤S2所述IPTG的终浓度为6.8～7mM。优选地，步骤S2所述诱导表达的时间为4.9～5h。优选地，步骤S3所述离心的条件为4℃下12000rpm离心10min。优选地，步骤S3所述可溶性蛋白抽提的方法如下：将菌体重悬于细菌裂解液（1.5%十二烷基氨酸钠，1mMPMSF，1%TritonX-100，1mg/mL溶菌酶）中，采用反复冻融法使菌体裂解，先于室温下裂解1h，放入-80℃中1h，取出置于37℃水浴中至其融化。反复三次，中间伴随振荡混匀。将反复冻融的菌体裂解液于4℃下12000rpm离心10min，收集上清。另外，本专利技术构建的表达载体在制备或合成大腹园蛛牵引丝蛋白方面的应用，以及由此制备得到的大腹园蛛牵引丝蛋白，均应在本专利技术的保护范围之内。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次构建出16倍体的拟大腹园蛛牵引丝蛋白基因的表达载体，并在大肠杆菌Rosetta（DE3）细胞株中成功表达，同时优化了表达体系，如IPTG诱导表达的时间和浓度等，整个流程简便高效。本专利技术的方法中采用Rosetta（DE3）宿主菌，该菌通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs，能明显增强带有大肠杆菌稀有密码子的16倍体的拟大腹园蛛牵引丝蛋白基因的表达，解决了16倍体的拟大腹园蛛牵引丝蛋白的表达困难或表达量较低的问题。本专利技术首次成功实现了大腹园蛛高分子牵引丝蛋白的体外表达，为今后利用高新技术大量生产大腹园蛛高分子牵引丝蛋白提供可靠的方法和途径，服务于社会的实际需求，具有很好的应用前景。附图说明图1为本专利技术采用的1836bp的拟大腹园蛛牵引丝蛋白基因。图2为本专利技术中使用的pET-28a-c(+)质粒图谱。图3为16倍串联体蛛丝蛋白基因表达的SDS-PAGE电泳图谱；注：M为蛋白Marker；1为pET-28a（+）空载菌体裂解离心上清液样品；2为pET-28a（+）-16倍串联体重组菌体裂解离心上清液样品，箭头所示目的蛋白所在的条带。图4为16倍串联体蛛丝蛋白基因表达的WesternBlot检测；注：M为蛋白Marker；1为pET-28a（+）空载菌体裂解离心上清液样品；2为pET-28a（+）-16倍串联体重组菌体裂解离心上清液样品，显色条带即为检测到的16倍串联体蛛丝蛋白基因表达的条带。图5为IPTG不同诱导时间下16倍串联体蛛丝蛋白基因表达的SDS-PAGE电泳图谱；注：M为蛋白Marker；Con为对照，1~5分别为2~6h诱导的16倍串联蛛丝蛋白基因重组菌体裂解离心上清液样品，箭头示目的蛋白表达条带。图6为IPTG不同诱导时间下16倍串联体蛛丝蛋白基因表达模拟图。图7为IPTG不同诱导浓度下16倍串联体蛛丝蛋白基因表达的SDS-PAGE电泳图谱；注：M为蛋白Marker；Con为对照，1~6分别为0.5、1、2、4、6、10mMIPTG诱导浓度下的16倍串联蛛丝蛋白基因重组菌体裂解离心上清液样品，箭头示目的蛋白表达条带。图8为IPTG不同诱导浓度下16倍串联体蛛丝蛋白基因表达模拟图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1构建大腹园蛛牵引丝蛋白基因的表达载体1、目的基因片段和线性载体的获取（1）目的基因片段酶切：选取16倍串联体的拟大腹园蛛牵引丝蛋白基因（序列如图1所示）克隆载体（即pSIMPLE-1916×质粒，见），以NheI和HindⅢ两种限制性核酸内切酶进行酶切。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大腹园蛛牵引丝蛋白的表达载体，其特征在于，构建方法如下：S1. 将16倍串联体的拟大腹园蛛牵引丝蛋白基因的克隆载体以

【技术特征摘要】
1.一种大腹园蛛牵引丝蛋白的表达载体，其特征在于，构建方法如下：S1.将16倍串联体的拟大腹园蛛牵引丝蛋白基因的克隆载体以NheI和HindⅢ两种限制性内切酶进行酶切，回收目的基因片段；S2.将pET-28a-c(+)质粒用限制性内切酶SpeI和HindIII进行双酶切，回收线性载体；S3.将回收的目的基因片段和线性载体进行连接；S4.将连接产物转化大肠杆菌Rosetta（DE3）表达型感受态细胞；S5.转化后的细胞在含Kan和氯霉素的选择性培养基上进行铺板培养，筛选阳性重组子。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，步骤S1和S2所述酶切的反应体系如下：质粒2μg、10×Quickcutbuffer5μL、内切酶各1μL、ddH2O补足50μL；酶切的反应步骤为：酶切反应体系轻轻混匀后瞬时离心，37℃保温2h。3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，步骤S3所述连接的反应体系如下：目的基因片段6μL、线性载体2μL、10×T4ligasebuffer1μL、T4连接酶1μL；连接的反应条件为：16℃下8h。4.权利要求1～3任一所述表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：王方海，刘婷婷，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44