一种可编程的多位点特异性的转录抑制系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种可编程的多位点特异性的转录抑制系统及其应用。本发明专利技术所提供的可编程的多位点特异性的转录抑制系统，包括如下A)和B)：A)位点特异性转录抑制蛋白FndCpf1(D917A)，或者能够表达所述FndCpf1(D917A)的DNA或RNA；B)由19‑36nt的重复序列以及可变的16‑31nt的间隔序列自5’端到3’端依次交替排列构成的靶向多个位点的可编程sgRNA，或者能够转录所述可编程sgRNA的DNA环状质粒或DNA线性片段。本发明专利技术获得了具有高效的、位点特异性的、且可同时靶向多个位点的基因转录调控工具。

Transcription of a programmable multiple specific suppression system and its application

The present invention discloses a programmable multi bit specific transcriptional inhibition system and its application. The transcription of programmable multilocus provided specific suppression system, including A and B)):A) site-specific transcription inhibition protein FndCpf1 (D917A), or to express the FndCpf1 (D917A) DNA or RNA; B) by 36nt and 19 repeat interval sequence the 16 31nt from the 5 'end to the 3' end are composed of alternately arranged targeting multiple sites of programmable sgRNA, or the DNA transcription plasmid or DNA fragments in a linear programming sgRNA. The present invention has a highly efficient, site-specific and gene transcription regulatory tool capable of simultaneously targeting multiple loci.

【技术实现步骤摘要】
一种可编程的多位点特异性的转录抑制系统及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种可编程的多位点特异性的转录抑制系统及其应用。
技术介绍
可编程的位点特异性的基因调控元件在全基因组层次的基因功能研究、代谢通路调控以及人工基因线路设计中均发挥重要作用。目前，研究人员已经开发了诸多可编程的基因调控元件，包括RNAi(RNAinterference)、工程化的DNA结合蛋白(如锌指蛋白ZFP(zinc-fingerprotein)、转录激活样效应蛋白TALE(transcription-activator-likeeffectorprotein)和基于CRISPR-Cas系统的CRISPRi。其中RNAi介导的基因敲低技术特异性较低且受作用机体限制，而基于DNA结合蛋白的调控技术，比如锌指蛋白ZFP及转录激活样效应蛋白TALE，在对特定位点进行调控时，需要对蛋白质序列进行重新设计，且得到的蛋白不一定具有良好的特异性，因而限制了其广泛应用。目前以Ⅱ型CRISPR-Cas9系统为基础的CRISPRi技术应用最为广泛，该技术系统中包含一个dCas9及一个工程化的sgRNA，对基因的特定位点进行调控时，只需要改变sgRNA中20bp的序列，而不要对蛋白序列做任何改变。尽管如此，该系统也存在一定问题，如多位点调控时sgRNA表达问题。而近期报道的Ⅴ-A型CRISPR-Cpf1系统，与CRISPR-Cas9系统相比，具有明显优势。首先，Cpf1在天然状态下由单个RNA引导，而Cas9在天然状态下由两个RNA(tracrRNA-crRNA)引导；其次，Cpf1蛋白除具有DNA切割酶活性外，还具有加工自身前体RNA(pre-RNA)的RNA酶活性，而Cas9只具有DNA切割酶活性，加工自身前体RNA时需要RNaseⅢ的参与；再者，与CRISPR-Cas9系统相比，该系统还具有更低的脱靶率，是除CRISPR-Cas9之外非常具有前景的基因组工程技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可编程的多位点特异性的转录抑制系统及其应用。本专利技术所提供的可编程的多位点特异性的转录抑制系统，可来自于CRISPR-Cpf1系统，具体可包括如下(A)和(B)：(A)位点特异性转录抑制蛋白，或者能够表达所述位点特异性转录抑制蛋白的DNA环状质粒或DNA线性片段或体外转录的RNA或mRNA；所述位点特异性转录抑制蛋白为将来自于弗朗西斯菌(Francisellanovicida)U112的Cpf1蛋白的第917位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸(D917A)后得到的蛋白；(B)靶向多个位点的可编程sgRNA，或者能够转录所述靶向多个位点的可编程sgRNA的DNA环状质粒或DNA线性片段；所述靶向多个位点的可编程sgRNA，由19-36nt的重复序列以及可变的16-31nt的间隔序列自5’端到3’端依次交替排列构成。其中，所述间隔序列为与预进行转录抑制的目的基因的靶标序列相结合的序列。对特定位点进行基因调控时，只需要改变所述靶向多个位点的可编程sgRNA中的所述间隔序列。更加具体的，所述转录抑制系统可为如下(a)或(b)或(c)：(a)由所述位点特异性转录抑制蛋白和所述靶向多个位点的可编程sgRNA组成；(b)由既能够表达所述位点特异性转录抑制蛋白也能够转录所述靶向多个位点的可编程sgRNA的DNA环状质粒或DNA线性片段组成；(c)由能够表达所述位点特异性转录抑制蛋白的DNA环状质粒或DNA线性片段或体外转录的RNA或mRNA，以及能够转录所述靶向多个位点的可编程sgRNA的DNA环状质粒或DNA线性片段组成。进一步，在所述靶向多个位点的可编程sgRNA中，所述重复序列的长度最好为19nt。所述间隔序列的长度最好为18-20nt。其中，所述重复序列为来自于弗朗西斯菌(Francisellanovicida)U112的sgRNA的重复序列。具体的，所述位点特异性转录抑制蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列1所示。所述靶向多个位点的可编程sgRNA中，所述重复序列为至少含有序列表中序列2自3’末端起的19个核苷酸，并且从序列2自3’末端起的第20个核苷酸起沿着序列2向5’端延长，得到的长度为19-36nt的单链RNA。在本专利技术中，所述可编程的多位点特异性的转录抑制系统具体由能够表达所述位点特异性转录抑制蛋白的DNA环状质粒，以及能够转录所述靶向多个位点的可编程sgRNA的DNA环状质粒组成。其中，所述“能够表达所述位点特异性转录抑制蛋白的DNA环状质粒”为FndCpf1表达质粒，所述FndCpf1表达质粒的全序列如序列表中序列3所示。所述“能够转录所述靶向多个位点的可编程sgRNA的DNA环状质粒”是将FnsgRNA_BCB质粒两个酶切位点BsmbI之间的片段替换为能够转录所述靶向多个位点的可编程sgRNA对应的DNA序列后得到的重组质粒；所述FnsgRNA_BCB质粒的全序列如序列表中序列4所示。所述转录抑制系统在抑制目的基因转录中的应用也属于本专利技术的保护范围。利用所述转录抑制系统抑制所述目的基因转录的过程中，最好以所述目的基因中符合如下条件的序列作为PAM序列：3’末端的碱基为A或C或G，5’端富含碱基T的序列。所述PAM序列的长度最好为4-6bp。进一步，所述PAM序列最好为5′-TTTTTV-3′、5′-TTTTV-3′或5′-TTTV-3′；其中，V为A或C或G。另外，CRISPR-Cpf1系统在制备用于抑制靶标基因转录的系统中的应用也属于本专利技术的保护范围。其中，所述CRISPR-Cpf1系统中的Cpf1蛋白为将来自于弗朗西斯菌(Francisellanovicida)U112的Cpf1蛋白的第917位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白。本专利技术比较了FrancisellanovicidaU112Cpf1(FnCpf1)的三种DNase失活突变体，FnCpf1(D917A)，FnCpf1(E1006A)，FnCpf1(D917A，E1006A)作为位点特异性基因调控蛋白的作用，并选择较优的突变体D917A，优化了多位点sgRNA设计及PAM序列选择，最终获得了具有高效的、位点特异性的、且可同时靶向多个位点的基因转录调控工具。附图说明图1为三个质粒的组成示意图。A：FndCpf1表达质粒；B：报告质粒；C：sgRNA表达质粒；D：FnsgRNA_BCB示意图及作用于不同位点的sgRNA的构建方法。图2为FndCpf1不同突变位点对抑制作用的影响。A：三种突变体在启动子区NTP1位置上的抑制作用曲线，其中Fnd1_NTP1、Fnd2_NTP1、Fnd12_NTP1分别对应D917A、E1006A、(D917A，E1006A)的突变体；阳性对照P，即不含有sgRNA，但含有FndCpf1及报告质粒的菌株；阴性对照N，即不含有报告质粒，但含有FndCpf1及sgRNA质粒的菌。该实验中IPTG的浓度为：0，7.8125，31.25，62.5，125，250，500，2000μM；(因为图为对数轴，横坐标无法显示0，所以图中横坐标1μMIPTG浓度下的荧光值实际对应0μMIPTG浓度下的数值)；B：三种突变体在NTP1位点的抑制倍数，即IPTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可编程的多位点特异性的转录抑制系统，包括如下(A)和(B)：(A)位点特异性转录抑制蛋白，或者能够表达所述位点特异性转录抑制蛋白的DNA环状质粒或DNA线性片段或体外转录的RNA或mRNA；所述位点特异性转录抑制蛋白为将来自于弗朗西斯菌(Francisella novicida)U112的Cpf1蛋白的第917位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白；(B)靶向多个位点的可编程sgRNA，或者能够转录所述靶向多个位点的可编程sgRNA的DNA环状质粒或DNA线性片段；所述靶向多个位点的可编程sgRNA，由19‑36nt的重复序列以及可变的16‑31nt的间隔序列自5’端到3’端依次交替排列构成。

【技术特征摘要】
1.一种可编程的多位点特异性的转录抑制系统，包括如下(A)和(B)：(A)位点特异性转录抑制蛋白，或者能够表达所述位点特异性转录抑制蛋白的DNA环状质粒或DNA线性片段或体外转录的RNA或mRNA；所述位点特异性转录抑制蛋白为将来自于弗朗西斯菌(Francisellanovicida)U112的Cpf1蛋白的第917位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸后得到的蛋白；(B)靶向多个位点的可编程sgRNA，或者能够转录所述靶向多个位点的可编程sgRNA的DNA环状质粒或DNA线性片段；所述靶向多个位点的可编程sgRNA，由19-36nt的重复序列以及可变的16-31nt的间隔序列自5’端到3’端依次交替排列构成。2.根据权利要求1所述的转录抑制系统，其特征在于：所述转录抑制系统为如下(a)或(b)或(c)：(a)由所述位点特异性转录抑制蛋白和所述靶向多个位点的可编程sgRNA组成；(b)由既能够表达所述位点特异性转录抑制蛋白也能够转录所述靶向多个位点的可编程sgRNA的DNA环状质粒或DNA线性片段组成；(c)由能够表达所述位点特异性转录抑制蛋白的DNA环状质粒或DNA线性片段或体外转录的RNA或mRNA，以及能够转录所述靶向多个位点的可编程sgRNA的DNA环状质粒或DNA线性片段组成。3.根据权利要求1或2所述的转录抑制系统，其特征在于：所述靶向多个位点的可编程sgRNA中，所述重复序列的长度为19nt；和/或所述靶向多个位点的可编程sgRNA中，所述间隔序列的长度...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗晨思，赵会伟，关莹，陈泽华，娄春波，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34