一种高活性抗冻蛋白AFP134的制备方法技术

该发明专利技术涉及抗冻蛋白领域，具体涉及基因工程表达抗冻蛋白领域。本发明专利技术利用先进的基因工程技术，构建了高效抗冻蛋白AFP134的原核表达载体，在原核表达系统中成功表达AFP134,并研发出了基于亲和层析和分子筛技术的纯化工艺。

Preparation method of antifreeze protein AFP134 with high activity

The invention relates to the field of antifreeze proteins, which specifically relates to the field of antifreeze protein expression by gene engineering. The present invention utilizes advanced genetic engineering techniques to construct a prokaryotic expression vector for highly efficient antifreeze protein AFP134, and successfully expresses AFP134 in prokaryotic expression system, and develops a purification process based on affinity chromatography and molecular sieve technology.

【技术实现步骤摘要】
一种高活性抗冻蛋白AFP134的制备方法
本专利技术涉及抗冻蛋白领域，具体涉及一种高活性AFP134抗冻蛋白。
技术介绍
抗冻蛋白(antifreezeprotein，AFP)首先由DeVries在南极鱼类中发现，具有阻止冰晶形成的功能1。之后，在许多物种中发现AFP的存在，包括昆虫和节肢动物2。这些AFP具有冰晶亲和力，能够降低冰晶形成温度，而不影响溶解温度，此种现象称为热滞活性(thermalhysteresis，TH)。此外，AFP利用自身冰晶亲和面与冰晶结合，从而阻止或抑制冰晶的生长3。AFP还能能够阻止冰的再结晶，从而避免细胞受到由冰晶导致的机械性损伤。AFPs有着比较广泛的应用,在改善冻融食品的质量和产品的储存方面具有潜在的应用价值。AFPs在疾病治疗如器官、组织、细胞等的低温保存等方面也有着潜在的重要性。目前所发现的活性最高的天然冰结构蛋白，为高寒地区野生甲虫类体内的小分子抗冻多肽。一种严寒地区的天牛甲虫R，能在零下25℃的极低温环境中存活。研究发现这种天牛甲虫能够在其组织和淋巴液中表达一种12.8kDaAFPs(RiAFP)，其抗冻活性可达6-6.5℃/mM，是迄今为止所发现的抗冻活性最高，具有极大开发潜力的抗冻蛋白4,5。但因自然条件苛刻，昆虫体内含量稀少，难以直接从昆虫体内直接分离纯化。[1]DeVriesAL,WohlschlagDE.FreezingresistanceinsomeAntarcticfishes.Science.1969；163:1073-5.[2]ZachariassenKE,LiNG,LaugsandAE,etal.Isthestrategyforcoldhardinessininsectsdeterminedbytheirwaterbalance？Astudyontwocloselyrelatedfamiliesofbeetles:CerambycidaeandChrysomelidae.JournalofcomparativephysiologyB,Biochemical,systemic,andenvironmentalphysiology.2008；178:977-84.[3]JiaZ,DaviesPL.Antifreezeproteins:anunusualreceptor-ligandinteraction.Trendsinbiochemicalsciences.2002；27:101-6.[4]ZachariassenKE,DeVriesAL,HuntB,etal.EffectoficefractionanddilutionfactorontheantifreezeactivityinthehemolymphofthecerambycidbeetleRhagiuminquisitor.Cryobiology.2002；44:132-41.[5]KristiansenE,RamlovH,HojrupP,etal.StructuralcharacteristicsofanovelantifreezeproteinfromthelonghornbeetleRhagiuminquisitor.Insectbiochemistryandmolecularbiology.2011；41:109-17.
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种高活性抗冻蛋白AFP134的制备方法，首先对RiAFP编码基因进行密码子优化，使其能在大肠杆菌中高效表达。将优化后的RiAFP编码序列插入表达载体PET28a+，转化工程菌株DH5a，IPTG诱导表达，筛选出高表达菌株。通过优化表达条件，使AFP134在DH5a内获得高表达。离心收集菌体后，超声破菌，上清经过Ni2+亲和层析和分子筛纯化，获得高纯度的AFP134蛋白。
技术实现思路
如下：一种高活性抗冻蛋白的制备方法，包括如下步骤：A、氨基酸密码子优化：Rhagiuminquisitor抗冻蛋白氨基酸序列(GeneBank：HQ540314.1)如下：其中下划线为抗冻蛋白氨基酸序列，加粗字体部分为6组氨酸标签序列MGSSSSGLVPRGSHMCRAVGVDGRAVTDIQGTCHAKATGAGAMASGTSEPGSTSTATATGRGATARSTSTGRGTATTTATGTASATSNAIGQGTATTTATGSAGGRATGSATTSSSASQPTQTQTITGPGFQTAKSFARNTATTTVTAS依据Rhagiuminquisitor抗冻蛋白氨基酸序列，使用大肠杆菌偏爱密码子对上述氨基酸序列进行编码，获得优化后的抗冻蛋白编码序列，在编码序列5’加上NdeI酶切位点，3’加上终止密码子taa和XhoI酶切位点，优化结果如下:下划线部分为氨基酸优化密码子，加粗字体为限制性酶切位点，小写字体为终止密码子5’TGTCGCGCGGTCGGCGTGGATGGTCGTGCGGTTACCGACATCCAGGGCACCTGCCACGCCAAAGCCACTGGTGCGGGCGCGATGGCCTCTGGTACCTCTGAACCTGGTAGCACTAGCACCGCAACGGCTACTGGTCGCGGTGCAACTGCTCGTAGCACCTCCACGGGCCGTGGCACTGCGACCACCACGGCGACTGGTACCGCATCTGCTACCTCCAATGCAATCGGCCAGGGTACCGCTACCACCACTGCAACTGGTTCTGCGGGCGGTCGTGCTACCGGCTCTGCAACCACTTCCTCTTCCGCTAGCCAACCAACCCAGACTCAGACGATTACGGGTCCGGGCTTTCAGACCGCGAAGTCCTTCGCTCGTAACACGGCCACCACCACCGTAACCGCGTCTtaa3’。其中，下划线部分为抗冻蛋白氨基酸序列，加粗字体部分为6×His标签B、表达载体构建：将步骤A得到的优化编码序进行合成，将合成的基因序列进行NdeI/XhoI双酶切，T4DNA连接酶连接于经上述双酶切的PET28a载体，构建重组质粒PET28a-AFP134，转化大肠杆菌DH5α；C、诱导表达：将PET-AFP134菌液接种到LB液体培养基中，30-45℃，150-250rpm振摇培养8-12h，取培养过的菌液接种到LB液体培养液中，30-45℃，150-250rpm振摇培养至OD600至0.6-0.8时，加入1M的IPTG，使IPTG终浓度为0.5mM，诱导4-8h；D、表达产物处理步骤C结束后，离心收集菌体，在细菌沉淀中加入4-8mL超声缓冲液,冰浴超声50次，每次4s，间隔9s，超声结束后10000-13000rpm离心20-40min，分离上清和沉淀；取上清50μL，加入50μL2×SDS上样缓冲液；沉淀加入500μL1×SDS上样缓冲液，均在100℃水浴加热5min；E、Ni-NTA分离带His标签的AFP134重组蛋白：1)Ni-NTA装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；2)用缓冲液1平衡2-5个床体积，流速为2ml/min；3)将20ml细胞破碎上清液0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高活性抗冻蛋白AFP134的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：A、氨基酸密码子优化：Rhagium inquisitor抗冻蛋白氨基酸序列(GeneBank：HQ540314.1)如下：其中下划线为抗冻蛋白氨基酸序列，加粗字体部分为6组氨酸标签序列MGSS

【技术特征摘要】
1.一种高活性抗冻蛋白AFP134的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：A、氨基酸密码子优化：Rhagiuminquisitor抗冻蛋白氨基酸序列(GeneBank：HQ540314.1)如下：其中下划线为抗冻蛋白氨基酸序列，加粗字体部分为6组氨酸标签序列MGSSSSGLVPRGSHMCRAVGVDGRAVTDIQGTCHAKATGAGAMASGTSEPGSTSTATATGRGATARSTSTGRGTATTTATGTASATSNAIGQGTATTTATGSAGGRATGSATTSSSASQPTQTQTITGPGFQTAKSFARNTATTTVTAS依据Rhagiuminquisitor抗冻蛋白氨基酸序列，使用大肠杆菌偏爱密码子对上述氨基酸序列进行编码，获得优化后的抗冻蛋白编码序列，在编码序列5’加上NdeI酶切位点，3’加上终止密码子taa和XhoI酶切位点，优化结果如下：下划线部分为氨基酸优化密码子，加粗字体为限制性酶切位点，小写字体为终止密码子5’TGTCGCGCGGTCGGCGTGGATGGTCGTGCGGTTACCGACATCCAGGGCACCTGCCACGCCAAAGCCACTGGTGCGGGCGCGATGGCCTCTGGTACCTCTGAACCTGGTAGCACTAGCACCGCAACGGCTACTGGTCGCGGTGCAACTGCTCGTAGCACCTCCACGGGCCGTGGCACTGCGACCACCACGGCGACTGGTACCGCATCTGCTACCTCCAATGCAATCGGCCAGGGTACCGCTACCACCACTGCAACTGGTTCTGCGGGCGGTCGTGCTACCGGCTCTGCAACCACTTCCTCTTCCGCTAGCCAACCAACCCAGACTCAGACGATTACGGGTCCGGGCTTTCAGACCGCGAAGTCCTTCGCTCGTAACACGGCCACCACCACCGTAACCGCGTCTtaa3’。B、表达载体构建：将步骤A得到的优化编码序进行合成，将合成的基因序列进行NdeI/XhoI双酶切，T4DNA连接酶连接于经上述双酶切的PET28a载体，构建重组质粒PET28a-AFP134，转化大肠杆菌DH5α；C、诱导表达：将PET-AFP134菌液接种...

【专利技术属性】
技术研发人员：奎翔，易晓佳，王燕，
申请(专利权)人：昆明医科大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：云南,53