一种产生三基因片段DNA融合方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种产生三基因片段DNA融合方法，其包括以下步骤：(1)获得包含A基因片段和C基因片段的质粒；(2)以步骤(1)中的质粒为模板，反向PCR扩增获得A基因片段和C基因片段分别位于产物两端的基因片段；(3)以含D基因片段的基因为模板，PCR扩增获得A’DC’基因片段；(4)将步骤(2)中得到的基因片段与步骤(3)中A’DC’基因片段进行体外同源重组；(5)将步骤(4)中的重组产物转化宿主细胞，获得含ADC基因片段的质粒；(6)以步骤(5)中的质粒为模板，PCR扩增获得ADC基因片段。本发明专利技术方法简单快速，非特异性扩增基因片段少，成本低，可广泛用于不同基因片段的融合、启动子和融合基因构建、带长同源臂的靶基因构建等。

DNA fusion method for producing three gene fragment and its application

The invention discloses a three DNA gene fragment fusion method, which comprises the following steps: (1) plasmid containing A gene and C gene; (2) to step (1) in the template of plasmid amplified gene fragment A gene and C gene were located at both ends of the product the reverse PCR; (3) with D gene fragment as template, PCR amplification of A gene fragment of 'DC'; (4) the step (2) gene fragments and steps obtained in (3) A in the 'DC' gene fragment homologous recombination in vitro; (5) the steps (4) recombinant product transformation of the host cell, plasmid containing ADC gene fragment; (6) to step (5) in the template of plasmid PCR amplified ADC gene fragment. The method of the invention is simple, rapid, non-specific amplification, less gene fragments and low cost, and can be widely used for the fusion of different gene fragments, the construction of promoters and fusion genes, and the construction of target genes with long homologous arms.

【技术实现步骤摘要】
一种产生三基因片段DNA融合方法及应用
本专利技术属于分子生物学及微生物学
，具体涉及一种产生三基因片段DNA融合方法及应用。
技术介绍
在分子生物学研究和微生物遗传操作中，常常需要进行DNA基因片段的融合，形成人工融合基因。交叠PCR(OverlapPCR)是应用最为广泛的产生双基因片段人工融合基因的方法。当用于双DNA基因片段融合时，交叠PCR方便、快速，不需要酶切和连接的步骤，因此也不需要人为引入外源无关的DNA基因片段，可以实现双基因片段无缝隙的嵌合。然而，目前并无交叠PCR用于三基因片段DNA融合的报道，在我们的研究工作中发现，采用交叠PCR进行三个基因片段融合时，交叠PCR表现出明显的局限性。以三基因片段A、D、C融合为例，当采用二步交叠策略时，需要进行二次交叠PCR，第一次交叠PCR产生二基因片段(AD)的融合，第二次交叠PCR产生三基因片段(ADC)融合。此方法虽可产生目的基因片段，但操作过程繁琐，且由于二轮交叠的扩增积累，会出现明显的非特异性扩增；当采用一步交叠时，需要将三基因片段混合在一起，虽然省了一次交叠步骤，但扩增的结果产生大量非特异性条段，无法使用，或者无目的条带产生。由于这些缺点，基于交叠PCR的三基因片段DNA融合往往具有困难，很难获得成功。基因合成技术的进步，为产生三基因片段DNA融合提供了另一种选择方案，可以直接将目的融合DNA全部合成并装配在常见质粒上(如：pUC59)，然而这种方案步骤多，往往需要一个月左右完成，并且三基因片段融合的DNA普遍较长，合成价格不菲，不适合大量使用。因此，需要探索发展新的三基因片段DNA融合的方法，解决上述问题。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种产生三片段DNA融合方法，其可应用于用于不同基因片段的融合、启动子+融合基因构建、带长同源臂的靶基因构建，成本非常低，特异性高，可以快速获取目的融合基因片段。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种产生三片段DNA融合方法，包含以下步骤：(1)获得包含A基因片段和C基因片段的质粒；(2)以步骤(1)中的质粒为模板，进行反向PCR扩增，获得A基因片段和C片段分别位于扩增产物两端的基因片段；(3)以含D基因片段的基因为模板，通过PCR扩增获得A’DC’基因片段，其中A’基因片段与A基因片段有18～20bp的碱基序列相同，C’基因片段与C基因片段有18～20bp的碱基序列相同；(4)将步骤(2)中扩增得到的基因片段与步骤(3)中A’DC’基因片段进行体外同源重组，获得重组产物；；(5)将步骤(4)中的重组产物转化宿主细胞，获得含ADC基因片段的质粒；(6)以步骤(5)中含ADC基因片段的质粒为模板，通过PCR扩增获得ADC基因片段。优选地，步骤(1)中所述获得包含A基因片段和C基因片段的质粒的方法为：当ABC基因片段为天然存在的一段DNA片段时，通过PCR扩增获得ABC基因片段，然后连接载体质粒和转化宿主细胞，获得含ABC基因片段的质粒；当AC基因片段在天然状态下不存在时，通过交叠PCR方法获得AC基因片段，然后连接载体质粒和转化宿主细胞，获得含AC基因片段的质粒。优选地，所述载体质粒为pMD19-T，所述宿主细胞为大肠杆菌DH5α(E.coliDH5α)。优选地，所述载体质粒与ABC基因片段或AC基因片段的摩尔比为1：(2～4)。优选地，步骤(3)中所述PCR扩增的上游引物5’端序列与步骤(1)中的A基因片段3’端有18～20bp的碱基序列相同，下游引物的5’端序列与步骤(1)中的C基因片段5’端有18～20bp的碱基序列反向互补。本专利技术提供的产生三片段DNA融合的方法，可以将目标A基因片段、D基因片段和C基因片段成功融合；根据实际融合需要，可将天然存在的一段基因序列划分为A基因片段、B基因片段和C基因片段，此时步骤(1)中以天然存在的基因序列为模板，通过PCR扩增获得ABC基因片段，然后连接载体质粒和转化宿主细胞，获得含ABC基因片段的质粒；步骤(2)以含ABC基因片段的质粒为模板，通过反向PCR扩增获得A基因片段和C基因片段分别位于扩增产物两端的基因片段；当目标A基因片段和C基因片段不是天然存在于一段基因序列时，步骤(1)中以A基因片段和C基因片段为模板通过交叠PCR方法获得AC基因片段，然后连接载体质粒和转化宿主细胞，获得含AC基因片段的质粒；步骤(2)以含AC基因片段的质粒为模板，通过反向PCR扩增获得A基因片段和C基因片段分别位于扩增产物两端的基因片段；步骤(3)中所述的D基因片段为天然存在的一个基因片段；所述的A’DC’基因片段在天然状态下不存在，其是由所述D基因片段通过PCR扩增获得的基因片段，其中A’基因片段与步骤(1)中的A基因片段有18～20bp的碱基序列相同，C’基因片段与步骤(1)中的C基因片段有18～20bp的碱基序列相同；步骤(5)或步骤(6)中所述ADC基因片段在天然状态下不存在，其是由A基因片段、D基因片段和C基因片段成功融合获得的融合基因片段。优选地，步骤(1)中所述A基因片段和C基因片段为将杀香鱼假单胞菌pcrV基因分成A、B、C三段所得，步骤(3)中所述的D基因片段为荧光假单胞菌luxI基因；或步骤(1)中所述A基因片段和C基因片段为将副球菌pka基因分成A、B、C三段所得，步骤(3)中所述的D基因片段为迟缓爱德华菌evp基因；或步骤(1)中所述A基因片段和C基因片段为将动物凡纳滨对虾凝集素基因lecV的cDNA分成A、B、C三段所得，步骤(3)中所述的D基因片段为细菌的卡那霉素抗性基因kan；或步骤(1)中所述A基因片段和C基因片段为将动物凡纳滨对虾凝集素基因补体基因vanC的cDNA分成A、B、C三段所得，步骤(3)中所述的D基因片段为细菌的氯霉素抗性基因cat。优选地，步骤(1)中的PCR扩增引物为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；或SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；或SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；或SEQIDNO：19和SEQIDNO：20。优选地，步骤(2)中的反向PCR扩增引物为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4；或SEQIDNO：9和SEQIDNO：10；或SEQIDNO：15和SEQIDNO：16；或SEQIDNO：21和SEQIDNO：22。优选地，步骤(3)中的PCR扩增引物为SEQIDNO：5和SEQIDNO：6；或SEQIDNO：11和SEQIDNO：12；或SEQIDNO：17和SEQIDNO：18；或SEQIDNO：23和SEQIDNO：24。本专利技术提供的三片段DNA融合方法可用于不同基因片段的融合、启动子和融合基因构建以及带长同源臂的靶基因构建。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：(1)不需要设置复杂的PCR扩增程序和探索最佳的扩增参数条件，操作简单，可以快速获取目的融合基因片段；(2)产生非特异性扩增的机率非常低；(3)通过克隆筛选，获得的扩增基因片段均来自于单一的模板，从而保证了特异性；(4)成本非常低。附图说明图1是本专利技术产生三片段DNA融合方法原理图；图2是本专利技术实施例1～4中ABC片段扩增结果电泳图。其中，M：分子量MarkerDL20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生三片段DNA融合方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)获得包含A基因片段和C基因片段的质粒；(2)以步骤(1)中的质粒为模板，进行反向PCR扩增，获得A基因片段和C基因片段分别位于扩增产物两端的基因片段；(3)以含D基因片段的基因为模板，通过PCR扩增获得A’DC’基因片段，其中A’基因片段与A基因片段有18～20bp的碱基序列相同，C’基因片段与C基因片段有18～20bp的碱基序列相同；(4)将步骤(2)中扩增得到的基因片段与步骤(3)中A’DC’基因片段进行体外同源重组，获得重组产物；(5)将步骤(4)中的重组产物转化宿主细胞，获得含ADC基因片段的质粒；(6)以步骤(5)中含ADC基因片段的质粒为模板，通过PCR扩增获得ADC基因片段。

【技术特征摘要】
1.一种产生三片段DNA融合方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)获得包含A基因片段和C基因片段的质粒；(2)以步骤(1)中的质粒为模板，进行反向PCR扩增，获得A基因片段和C基因片段分别位于扩增产物两端的基因片段；(3)以含D基因片段的基因为模板，通过PCR扩增获得A’DC’基因片段，其中A’基因片段与A基因片段有18～20bp的碱基序列相同，C’基因片段与C基因片段有18～20bp的碱基序列相同；(4)将步骤(2)中扩增得到的基因片段与步骤(3)中A’DC’基因片段进行体外同源重组，获得重组产物；(5)将步骤(4)中的重组产物转化宿主细胞，获得含ADC基因片段的质粒；(6)以步骤(5)中含ADC基因片段的质粒为模板，通过PCR扩增获得ADC基因片段。2.根据权利要求1所述的产生三片段DNA融合方法，其特征在于，步骤(1)中所述获得包含A基因片段和C基因片段的质粒的方法为：当ABC基因片段为天然存在的一段DNA片段时，通过PCR扩增获得ABC基因片段，然后连接载体质粒和转化宿主细胞，获得含ABC基因片段的质粒；当AC基因片段在天然状态下不存在时，通过交叠PCR方法获得AC基因片段，然后连接载体质粒和转化宿主细胞，获得含AC基因片段的质粒。3.根据权利要求1或2所述的产生三片段DNA融合方法，其特征在于，所述载体质粒为pMD19-T，所述宿主细胞为大肠杆菌DH5α。4.根据权利要求1或2所述的产生三片段DNA融合方法，其特征在于，所述载体质粒与ABC基因片段或AC基因片段的摩尔比为1：(2～4)。5.根据权利要求1所述的产生三片段DNA融合方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR扩增的上游引物5’端序列与步骤(1)中A基因片段3’端有18～20bp的碱基序列相同，下游引物的5’端序列与步骤(1)中C基因片段5’端有18～20bp的碱基序列反向互补。6.根据权利要求1～6任一项所述的产生三片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗鹏，赵喜珍，何香燕，卢泽禹，
申请(专利权)人：广州诺晶生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44