表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体及应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M+N双基因的原核融合表达载体。通过PEDV的M和N基因片段，利用Blunt‑E2表达载体，通过无缝克隆技术，构建出表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体，并提供了其在基因工程蛋白重组表达中的应用。本发明专利技术是直接将纯化PEDV的M基因片段连接到Blunt‑E2哺乳动物原核融合表达载体中，不需要连接至单克隆载体PMD19‑T中，然后M+Blunt‑E2质粒通过同源重组技术，无缝拼接N基因片段，从而获得M+N双基因融合表达载体，其质粒通过PCR技术进行鉴定，测序准确后再转染在细胞中获得成功表达。因此，该原核融合表达载体的制备比较其他原核融合表达技术，具有操作步骤简单、反应时间短等特点。

Prokaryotic fusion expression vector of M+N double gene expressing PEDV and its application

The present invention belongs to the field of molecular biology, and specifically relates to a prokaryotic fusion expression vector expressing the M+N double gene of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV). By M and N PEDV gene fragment, using Blunt expression vector E2, through seamless cloning technology, construct the expression of PEDV M+N gene prokaryotic fusion expression vector, and its application in recombinant protein expression in. The invention is a M gene fragment of purified PEDV directly connected to the Blunt E2 mammalian prokaryotic fusion expression vector, does not need to be connected to the PMD19 vector monoclonal T, M+Blunt and E2 plasmid by homologous recombination, seamless splicing of N gene fragment obtained fusion M+N double gene expression vector. The plasmid was identified through PCR Technology, accurate sequencing after transfection in cells successfully expressed. Therefore, the preparation of the prokaryotic fusion expression vector is compared with other prokaryotic fusion expression techniques, which has the characteristics of simple operation steps and short reaction time.

【技术实现步骤摘要】
表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体及应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体及其应用。
技术介绍
猪流行性腹泻(PED)由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起猪群呕吐、腹泻、脱水及死亡为特征的消化道病毒性疾病。该病于1971年首次在英国报道，我国在1984年证实该病在的存在。自2010年下半年以来，由于传统的PEDV在基因上发生了缺失、插入及变异，导致该病对猪群的致病性增强，造成了大量的猪群发病死亡，损失惨重。目前世界上大多数养猪国家都有发生变异PEDV的报道，尤其以中国、韩国、日本、泰国和美国等国家发病严重，给养猪业造成了巨大的经济损失，并已成为影响全球养猪业健康发展的重要疫病之一。PEDV的基因组长大约在28000bp左右，主要含有4个结构蛋白，分别为S、M、N及E蛋白。目前，已见通过PEDV的单个基因如N、S及M基因段片，通过原核表达方法表达出单基因蛋白，但未见通过PEDV的M和N基因片段，利用pEASY-Blunt-E2原核表达载体，通过无缝克隆技术，构建出PEDV的M+Blunt-E2+N的双基因原核表达载体。因此，一种表达PEDV的M+N双基因原核表达载体的构建，对今后开展该病或其他病原的诊断技术研究，具有重要意义和应用前景。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体的制备方法，以及由该制备方法制备的载体。本专利技术的另一个目的是提供所述的原核融合表达载体在基因工程蛋白重组表达中的应用。本专利技术是这样实现的：本专利技术首先提供了一种表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体的制备方法，包括如下步骤：(1)根据PEDV的M、N基因及pEASY-Blunt-E2表达载体基因的片段序列，设计与合成特异性引物；(2)以PEDV的cDNA为模板，通过PCR技术分别扩增出M与N基因片段，并进行回收纯化，将纯化的M基因片段连接到pEASY-Blunt-E2表达载体上，构建出M+Blunt-E2质粒；(3)以M+Blunt-E2质粒为模板，扩增质粒的基因片段，回收纯化M+Blunt-E2基因片段；(4)采用pEASY-UniSeamlessCloningandAssemblykit，通过无缝克隆技术将M+Blunt-E2基因与N基因片段进行重组连接，将连接产物再转化至Trans1-T1感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素抗性的LB培养基进行培养后，提取M+Blunt-E2+N质粒进行测序鉴定，得到表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体。所述PEDV优选变异猪流行性腹泻病毒。其中步骤(1)所述特异性引物序列如下：M：M-F:ATGTCTAACGGTTTTATTCCM-R:GACTAAATGAAGCACTTTCTE2+M：E2+M-F:AAGGGCCAATTCCTCGAGCACE2+M-R:GACTAAATGAAGCACTTTCTN(包含载体部分同源臂)：N-F:GAGAAAGTGCTTCATTTAGTCGCTTCTGTCAGCTTTCAGGATN-R:TGCTCGAGGAATTGGCCCTTATTTCCTGTATCGAAGATCTC。其次，本专利技术提供了由所述制备方法制备的表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体。另外，本专利技术还提供了所述的表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体在基因工程蛋白重组表达中的应用。本专利技术具有如下优点：本专利技术是直接将纯化PEDV的M基因片段连接到Blunt-E2原核表达载体中，不需要连接至单克隆载体PMD19-T中，然后M+Blunt-E2质粒通过同源重组技术，无缝拼接N基因片段，从而获得M+N双基因融合表达载体。因此，该原核融合表达载体的制备比较其他原核融合表达技术，具有操作步骤简单、反应时间短等特点。附图说明下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的说明。图1是M基因片段扩增结果。图2是N基因片段扩增电泳图。图3是M+N片段无缝拼接的菌落PCR鉴定结果。图4是所用感受态细胞为Transetta(DE3)在37℃和16℃诱导表达蛋白结果；图中标号表示：1未诱导，2上清(37℃)，3沉淀(37℃)，4上清(16℃)，5沉淀(16℃)。图5是所用感受态细胞为Transetta(DE3)在37℃诱导表达纯化蛋白；图中标号表示：其中1未诱导对照；2上清；3沉淀；4PBS包涵体穿透液；5PBS洗涤后包涵体；6尿素包涵体穿透液；7尿素洗后的包涵体。图6是蛋白WB电泳图。具体实施方式实施例1实施本专利技术的技术前需要克服以下技术难题：引物设计，要根据所表达基因及Blunt-E2载体的基因序列，结合同源重组原理，设计与和合成引物。生物材料来源：pEASY-BluntE2表达载体、pEASY-UniSeamlessCloningandAssemblykit均购自北京全式金生物技术有限公司。一、根据GenBank中公开的的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M和N基因及Blunt-E2+M质粒序列，设计合成相关扩增引物，序列如下表1。表1引物序列二、RT反应：以PEDV(该病毒株来源于2013年福建某规模猪场发生PEDV的哺乳小猪的小肠，将小肠用PBS液研磨，吸取上清，采用商品化试剂盒提取RNA)的RNA为模板，进行反转录，合成cDNA,其体系如下表2。表2反转录体系反应条件：25℃10min；50℃30min；85℃5s三、M片段的PCR扩增：以cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增体系如下表3。表3M片段的PCR扩增体系反应条件如下：通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，获得目的片段如图1。四、M基因片段连接至E2载体1、连接体系如下：2.0μlM片段，1.0μlBlunt-E2载体，使用ddH2O补齐体积至5.0μl,25℃连接10min；2、连接产物转化至Trans1-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；3、42℃热激30s，立即置于冰上2min；4、加入平衡至室温的LB培养基，250rpm，37℃培养1h；5、4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100μl，轻弹重悬后涂于Amp+抗性平板上，37℃培养过夜；6、分别挑单克隆菌株至10μl无菌水中，涡旋混匀后进行PCR鉴定，反应体系如下表4。表4PCR反应体系反应条件如下：7、使用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，获得目的片段。取阳性菌落送测序公司测序准确，再将目的质粒作为模板进行PCR扩增，获得线性载体。五、M+E2片段的PCR扩增以M+E2质粒为模板，进行扩增，扩增体系如下表5。表5扩增体系反应体系如下，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，获得目的条带。六、N片段的PCR扩增以PEDV的cDNA为模板，进行扩增，扩增体系如下表6。表6扩增体系反应体系如下,使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,获得目的片段1320bp，如图2。七、纯化片段分别胶回收纯化PCR扩增的N片段和PCR扩增的M+E2片段，采用纯化试剂盒进行纯化。八、无缝拼接1.以pEASY-UniSeamlessCloningandAssemblyKit推荐体系进行重组反应，连接体系如下：2×AssemblyMix5μl；纯化回收N片段2μl；纯化回收E2+本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)根据PEDV的M、N基因及pEASY‑Blunt‑E2表达载体基因的片段序列，设计与合成特异性引物；(2)以PEDV的cDNA为模板，通过PCR技术分别扩增出M与N基因片段，并进行回收纯化，将纯化的M基因片段连接到pEASY‑Blunt‑E2表达载体上，构建出M+Blunt‑E2质粒；(3)以M+Blunt‑E2质粒为模板，扩增质粒的基因片段，回收纯化M+Blunt‑E2基因片段；(4)采用pEASY‑Uni Seamless Cloning and Assembly kit，通过无缝克隆技术将M+Blunt‑E2基因与N基因片段进行重组连接，将连接产物再转化至Trans 1‑T1感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素抗性的LB培养基进行培养后，提取M+Blunt‑E2+N质粒进行测序鉴定，得到表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体。

【技术特征摘要】
1.一种表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)根据PEDV的M、N基因及pEASY-Blunt-E2表达载体基因的片段序列，设计与合成特异性引物；(2)以PEDV的cDNA为模板，通过PCR技术分别扩增出M与N基因片段，并进行回收纯化，将纯化的M基因片段连接到pEASY-Blunt-E2表达载体上，构建出M+Blunt-E2质粒；(3)以M+Blunt-E2质粒为模板，扩增质粒的基因片段，回收纯化M+Blunt-E2基因片段；(4)采用pEASY-UniSeamlessCloningandAssemblykit，通过无缝克隆技术将M+Blunt-E2基因与N基因片段进行重组连接，将连接产物再转化至Trans1-T1感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素抗性的LB培养基进行培养后，提取M+Blunt-E2+N质粒进行测序鉴定，得到表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体。2.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王隆柏，陈秋勇，吴学敏，王晨燕，周伦江，车勇良，刘玉涛，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35