一种产红景天苷及其类似物的重组菌及构建方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种产红景天苷及其类似物的重组菌及构建方法及用途，其构建方法为：合成酮基脱羧酶基因synkdc和糖基转移酶基因synyjic，连接到载体pRSFDuet‑1上，构建重组载体pSynkdc1‑yjic；将T7RNA聚合酶基因游离或整合到SyBE‑002447底盘菌株中，引入pSynkdc1‑yjic，得到SyBE‑218011和SyBE‑218013菌株；将synkdc和synyjic直接整合至SyBE‑002447染色体，同时敲除feaB和ushA，得到SyBE‑218015菌株；本发明专利技术的菌株，发酵生产红景天苷及其类似物，可解决红景天苷及其类似物的来源问题，降低成本。

Recombinant bacteria and its construction methods and uses for salidroside and its analogues

The recombinant bacteria of the invention discloses a production of salidroside and its analogues and construction method and application of the construction method for synthesis of ketone based carboxylase gene synkdc and glycosyltransferase genes synyjic, pRSFDuet 1 connected to the carrier, to construct a recombinant vector pSynkdc1 yjic T7RNA polymerase gene; free or integrated into SyBE 002447 chassis strains, the introduction of pSynkdc1 yjic, SyBE 218011 and SyBE 218013 strain; synkdc and synyjic integration directly to the SyBE 002447 chromosomes, while knockdown of feaB and ushA, SyBE 218015 strain; the strain of the invention, the production of salidroside and its analogues from fermentation, can solve the problem salidroside and its analogues, reduce costs.

【技术实现步骤摘要】
一种产红景天苷及其类似物的重组菌及构建方法及用途
本专利技术所属生物医药
，涉及一种产红景天苷及其类似物的重组菌及构建方法。
技术介绍
红景天苷(salidroside)是景天科(Crassulaceae)红景天属植物红景天(Rhodiolarosea)的主要有效成分，具有良好的抗氧化、抗辐射、抗疲劳、免疫调节、抗高原低氧等多种药理活性。其分子式为C14H20O7，分子量为300.30，类白色或浅黄色粉末。近年来，研究发现红景天苷可用于癌症、神经系统疾病、细胞衰老、脑与心脏等器官缺氧与缺血、认知障碍、皮肤斑哺、代谢调节等多方面的治疗，因此使得红景天苷在药品、保健品、化妆品等工业生产中有广泛使用。目前为止，红景天苷的主要来源依然是野生红景天，野生红景天中红景天苷的量很低,而且天然红景天苷的提取需要复杂的工艺，现在最常用的高山红景天和大花红景天，其植株中红景天苷的量只有0.5％-0.8％。而人工栽培的红景天成本颇高而有效成分量低。近几年，在化学合成、生物催化(酶催化)合成红景天苷等方面，相关理论和实践都取得了重要进步。尽管化学合成红景天苷及其类似物技术已日趋成熟，但大多都需要进行选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂。因此以上方法均不利于工业生产。植物中红景天苷的生物合成分为4个阶段：第一阶段是初生代谢产物磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸经莽草酸途径形成莽草酸；第二阶段是由莽草酸再经几步酶促反应形成阿罗酸；第三阶段是由阿罗酸到酪醇的合成；第四阶段是由葡萄糖和酪醇结合形成红景天苷。在这4个阶段中，第l阶段是许多高等植物所共有的代谢步骤，是十分明确的，第2阶段和第4阶段的反应机制也已经被探索清楚；关于第3阶段，从阿罗酸到酪醇的生物合成途径，已经提出了3条可能的途径，即苯丙烷类代谢途径、酪氨酸脱羧代谢途径和酪氨酸转氨代谢途径。近年来也已有研究证实酪氨酸可以经过脱羧、还原等步骤直接转化成酪醇。而红景天苷生物合成最后一步反应机制也已经明确，植物体内的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UDPGT，UGTs)以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和酪醇为底物催化合成红景天苷。因此，通过使用合成生物学技术，在工程微生物中构建全新的生物合成通路，实现红景天苷及其类似物的从头合成。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能利用毕赤酵母菌(PichiapastorisGS115)中酮基脱羧酶基因kdc以及地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)中的糖基转移酶基因yjic，实现了以葡萄糖等生物质碳源合成红景天苷及其类似物的一种产红景天苷及其类似物的重组菌。本专利技术的第二个目的是提供一种产红景天苷及其类似物的重组菌的构建方法。本专利技术的第三个目的是提供一种产红景天苷及其类似物的重组菌发酵制备红景天苷及其类似物的方法。本专利技术的技术方案概述如下：(1)人工全合成酮基脱羧酶基因synkdc，所述酮基脱羧酶基因synkdc如SEQIDNo.03所示；人工全合成糖基转移酶基因synyjic，所述糖基转移酶基因synyjic如SEQIDNo.04所示；(2)将synkdc基因通过酶切，连接到表达载体pRSFDuet-1的第一个启动子下游，筛选阳性克隆得到重组载体为pSynkdc1；(3)将synyjic基因连接到pSynkdc1的第二个启动子下游，筛选阳性克隆得到重组载体pSynkdc1-yjic；(4)从大肠杆菌BL21(DE3)菌中克隆得到T7RNA聚合酶基因，连接到载体pYSC1上，筛选阳性克隆得到重组载体为pYBH1；(5)按下述三种方式之一种进行：方式一：①从大肠杆菌BL21(DE3)菌中克隆得到T7RNA聚合酶基因，通过λRed同源重组技术整合到SyBE-002447底盘菌株染色体上得到SyBE-002447(DE3)菌株；②将重组载体pSynkdc1-yjic转化到大肠杆菌SyBE-002447(DE3)中，得到SyBE-218011菌株；方式二：①将重组载体pYBH1转化到大肠杆菌SyBE-002447中，得到SyBE-218012菌株；②将重组载体pSynkdc1-yjic转化到大肠杆菌SyBE-218012中，得到SyBE-218013菌株；方式三：①将synkdc基因，通过λRed同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE-002447(DE3)中，同时敲除基因feaB，得到SyBE-218014菌株；①将synyjic基因，通过λRed同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE-218014菌株中，同时敲除基因ushA，得到SyBE-218015菌株。上述方法构建的产红景天苷及其类似物的重组菌SyBE-218011菌株、SyBE-218013菌株或SyBE-218015菌株。产红景天苷及其类似物的重组菌制备红景天苷及其类似物的方法，包括如下步骤：将重组菌SyBE-218011、SyBE-218013或SyBE-218015接种在LB培养基中，37℃，220rpm，震荡培养2-4h，在OD600到达0.8-1.0之间时，然后转接到含有葡萄糖的M9培养基或红景天苷植物原料酶水解的培养基中，进行发酵，当葡萄糖浓度低于0.5g/L时，补加5g/L葡萄糖，持续合成红景天苷及其类似物。本专利技术的优点：红景天苷可用于癌症、神经系统疾病、细胞衰老等多方面的治疗，因此使得红景天苷在化妆品、食品、保健品、药品等工业生产中被广泛使用。本专利技术使用工程大肠杆菌，葡萄糖为碳源，利用游离诱导表达和整合表达不同策略进行发酵生产红景天苷及其类似物。本专利技术可解决红景天苷及其类似物的来源问题，同时最大限度的降低了生产成本，有利于工业化生产。附图说明图1为红景天苷及其类似物(苯乙醇-β-D-吡喃葡萄糖苷)的合成路线。图2为红景天苷及其类似物验证的HPLC图谱。(a)为重组菌SyBE-218011的发酵液检测图谱，(b)为重组菌SyBE-218013的发酵液检测图谱，(c)为重组菌SyBE-218015的发酵液检测图谱。具体实施方式利用毕赤酵母菌(PichiapastorisGS115)中酮基脱羧酶基因kdc以及地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)中的糖基转移酶基因yjic，在工程大肠杆菌中实现了以葡萄糖为生物质碳源合成红景天苷及其类似物，使生产成本最低化。原始底盘大肠杆菌是高产酪氨酸的菌株，名称为SyBE-002447，分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.7962。保藏时间为2013年7月22日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。本专利技术所用大肠杆菌菌株E.coliBL21(DE3)和E.coliDH5α购买自北京全式金生物技术有限公司。本专利技术所用表达载体pRSFDuet-1购买自Novagen公司。本专利技术所用pKD46质粒和pCP20质粒购买自普如汀生物技术(北京)有限公司。LB培养基组成为：10g/LNaCl、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。含有葡萄糖的M9培养基组成为：0.5g/LNaCl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产红景天苷及其类似物的重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)人工全合成酮基脱羧酶基因synkdc，所述酮基脱羧酶基因synkdc如SEQ ID No.03所示；人工全合成糖基转移酶基因synyjic，所述糖基转移酶基因synyjic如SEQ ID No.04所示；(2)将synkdc基因通过酶切，连接到表达载体pRSFDuet‑1的第一个启动子下游，筛选阳性克隆得到重组载体为pSynkdc1；(3)将synyjic基因连接到pSynkdc1的第二个启动子下游，筛选阳性克隆得到重组载体pSynkdc1‑yjic；(4)从大肠杆菌BL21(DE3)菌中克隆得到T7RNA聚合酶基因，连接到载体pYSC1上，筛选阳性克隆得到重组载体为pYBH1，所述pYSC1载体序列如SEQ ID No.05所示；(5)按下述三种方式之一种进行：方式一：①从大肠杆菌BL21(DE3)菌中克隆得到T7RNA聚合酶基因，通过λRed同源重组技术整合到SyBE‑002447底盘菌株染色体上得到SyBE‑002447(DE3)菌株；②将重组载体pSynkdc1‑yjic转化到大肠杆菌SyBE‑002447(DE3)中，得到SyBE‑218011菌株；方式二：①将重组载体pYBH1转化到大肠杆菌SyBE‑002447中，得到SyBE‑218012菌株；②将重组载体pSynkdc1‑yjic转化到大肠杆菌SyBE‑218012中，得到SyBE‑218013菌株；方式三：①将synkdc基因，通过λRed同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE‑002447(DE3)中，同时敲除基因feaB，得到SyBE‑218014菌株；②将synyjic基因，通过λRed同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE‑218014菌株中，同时敲除基因ushA，得到SyBE‑218015菌株。...

【技术特征摘要】
1.一种产红景天苷及其类似物的重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)人工全合成酮基脱羧酶基因synkdc，所述酮基脱羧酶基因synkdc如SEQIDNo.03所示；人工全合成糖基转移酶基因synyjic，所述糖基转移酶基因synyjic如SEQIDNo.04所示；(2)将synkdc基因通过酶切，连接到表达载体pRSFDuet-1的第一个启动子下游，筛选阳性克隆得到重组载体为pSynkdc1；(3)将synyjic基因连接到pSynkdc1的第二个启动子下游，筛选阳性克隆得到重组载体pSynkdc1-yjic；(4)从大肠杆菌BL21(DE3)菌中克隆得到T7RNA聚合酶基因，连接到载体pYSC1上，筛选阳性克隆得到重组载体为pYBH1，所述pYSC1载体序列如SEQIDNo.05所示；(5)按下述三种方式之一种进行：方式一：①从大肠杆菌BL21(DE3)菌中克隆得到T7RNA聚合酶基因，通过λRed同源重组技术整合到SyBE-002447底盘菌株染色体上得到SyBE-002447(DE3)菌株；②将重组载体pSynkdc1-yjic转化到大肠杆菌SyBE-002447(DE3)中，得到SyBE-218011菌株；方式二：①将重组载...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵广荣，李晓波，刘雪，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12