双特异性四价抗体及其制备和使用方法技术

一种双特异性四价抗体，其包含具有一对重链和一对轻链的IgG，并且两个scFv组分连接至重链或轻链的C端或N端。双特异性四价抗体可以对HER2受体上的两种不同表位具有结合特异性。

Bispecific tetravalent antibody and its preparation method and use

A bispecific tetravalent antibody, which includes having a pair of heavy chain and a light chain of IgG, and two scFv were connected to a heavy or light chain C or N terminal. Bispecific tetravalent antibody can have on the HER2 receptor on two different epitope binding specificity.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双特异性四价抗体及其制备和使用方法相关专利申请的交叉引用本申请要求于2014年12月22日提交的题为“BISPECIFICANTIBODIES(双特异性抗体)”的美国第62095348号临时申请的优先权，其通过引用整体并入本文。序列表与本申请相关的序列表以文本格式提供，代替纸质副本，并通过引用并入说明书中。包含序列表的文本文件名为SequenceListing_ST25_0003PCT2.txt。文本文件约为164KB，于2015年12月18日创建，并经由EFS-Web提交电子版。
本公开总体上涉及抗体的
，更具体地涉及双特异性抗体。
技术介绍
HER2是ErbB/HER受体家族的成员，在乳腺和卵巢的几种癌症中过表达和/或失调(King,KrausandAaronson,Science1985；229:974-976；Slamonetal.,Science1989；244:707-712)。HER2靶向治疗药物已经在临床上成功使用，并已被美国FDA批准。这样的抗体治疗药物包括曲妥珠单抗(Horton,CancerControl2001:8(1),103-110)和帕妥珠单抗(BadacheandHynes,CancerCell；5(4):299-301)。一些研究表明，与单一抗体单药治疗相比，可以通过组合两种或多种表位不同的抗HER2抗体(诸如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)来实现增强治疗(Kasprzyketal.,CancerRes1992；52:2771-2776,Ben-Kasusetal.,ProcNatlAcadSciUSA,106(9)3294-3329)。结合HER2细胞外结构域4的曲妥珠单抗抑制非配体依赖性信号传导、刺激ADCC、阻断HER2脱落但不抑制HER2二聚化。与细胞外结构域2结合的帕妥珠单抗抑制HER2二聚化和与其他HER家族受体的二聚化，抑制多种配体依赖性HER介导的信号通路并刺激ADCC(O'SullivanandConnolly,Oncology2014；28(3):186-194)。基于单独使用曲妥珠单抗的显著临床益处，FDA已经于2013年批准了曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合治疗HER2阳性转移性癌症作为HER2阳性乳腺癌的新治疗方法，(Baselgaetal.NEnglJMed.2012Jan12；366(2):109-19)。然而，使用两种或多种单克隆抗体的简单组合的功效是次优的。此外，单独生产两种或多种单克隆抗体的成本高。因此，需要通过组合单克隆抗体来改善癌症治疗的功效并降低与单克隆抗体生产相关的成本。
技术实现思路
本公开提供双特异性四价抗体。双特异性四价抗体可以包括两条IgGl重链；两条kappa轻链；以及两个单链Fv(scFv)结构域。两条IgGl重链和kappa轻链可以形成对HER2的第一结构域具有结合特异性的IgG部分。两个scFv结构域可以对HER2的第二结构域具有结合特异性。IgG部分和两个scFv结构域共价连接，作为双特异性四价抗体起作用。从以下结合附图对其优选实施例的详细描述中，本公开的目的和优点可变得显而易见。附图说明现在可以参考附图来描述根据本公开的优选实例，其中相同的附图标记表示相同的元件。图1示出了根据本专利技术一实例的四价双特异性抗体结构。图2示出了根据本专利技术的实例的示例性四价双特异性抗体4X1、4X2、4X3和4X4的功能框图。图3示出了示例性单特异性抗体4C1和4C2的功能框图。图4示出了示例性Fc-scFv抗体4C3、4C4、4C5、4C6、4C7、4C8、4C10和4C11的功能框图。图5示出了SI-4X和SI-4C抗体对BT-474细胞增殖的作用。图6示出了将连接体长度从10个氨基酸扩展到30个氨基酸对BT-474细胞增殖的作用。图7示出了将连接体长度扩展到40个氨基酸对BT-474细胞增殖的作用。图8示出了SI-4X抗体对BT-474细胞上HER2内化的作用。具体实施方式本公开提供了双特异性四价抗体。该抗体可以具有同时靶向HER2的细胞外结构域2和4的优点。必须注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则在整个本说明书和权利要求书中，单数形式“一”、“和”以及“该”，词语“包含”或诸如“包含”或“包含……的”将被理解为暗示包含所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，包括复数对象。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fab'-SH；双抗体；线性抗体(参见美国专利第5,641,870号，实例2；Zapataetal.,ProteinEng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子(例如，scFv)。尽管在本说明书中并且在整个说明书中，提及抗体和抗体的各种性质，但是相同的公开内容也适用于功能性抗体片段，例如，双重作用Fab片段。一方面，双特异性四价抗体可以包括两条IgGl重链；两条kappa轻链；以及两个单链Fv(scFv)结构域。两条IgGl重链和kappa轻链可以形成对HER2的第一结构域具有结合特异性的IgG部分。两个scFv结构域可以对HER2的第二结构域具有结合特异性。每个scFv结构域可以通过具有氨基酸序列(gly-gly-gly-gly-ser)n((G4S)n)的连接体与任一个IgGl重链的C端残基连接。每个scFv结构域可以具有N端-可变重链-接头-可变轻链-C端或N端-可变轻链-接头-可变重链-C端的结构顺序，并且接头可以包括(gly-gly-gly-gly-ser)m((G4S)m)氨基酸序列。n和m均为整数，n可以是至少为2的整数。在一实施例中，n为1至10或2至9。在一些实施例中，n至少为9。在一些实施例中，n为2至20。m可以是至少为2的整数。在一些实施例中，m可以是2、3、4或5。在一些实施例中，m可以是选自2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数。在一些实施例中，IgGl重链或kappa轻链中的至少一个是人源化的或人的。在一些实施例中，两条IgGl重链均是人源化的或人的。在一些实施例中，两条kappa轻链均是人源化的或人的。在一些实施例中，HER2的结构域独立地选自HER2的结构域2和结构域4。在一些实施例中，双特异性四价抗体可以包括具有经由肽接头连接到重链或轻链的C端或N端的scFv的IgG部分。IgG部分可以对HER2(人表皮生长因子2)表达细胞的细胞外结构域2或4具有结合特异性，而scFv结构域可以分别对HER2表达细胞的胞外域4或2具有结合特异性。结合可以是二价的。肽接头的长度可能不同。在一些实施例中，肽接头可包括约15至约45个氨基酸。在一些实施例中，肽接头可包括约20至约50个氨基酸。在一些实施例中，肽接头可包括约10至约30个氨基酸。在一些实施例中，IgG部分可以对HER2的结构域2具有结合特异性。在一些实施例中，scFv结构域可以对HER2的结构域4具有结合特异性。在一些实施例中，IgG部分可以对HER2的结构域4具有结合特异性。在一些实施例中，scFv结构域可以对HER2的结构域2具有结合特异性。在一些实施例中，IgGl重链中的至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双特异性四价抗体，所述双特异性四价抗体包含：两条IgGl重链；两条kappa轻链；以及两个单链Fv(scFv)结构域。其中所述两条IgGl重链和kappa轻链形成对HER2的第一结构域具有结合特异性的IgG部分；其中所述两个scFv结构域对HER2的第二结构域具有结合特异性，并且每个scFv结构域通过具有氨基酸序列(gly‑gly‑gly‑gly‑ser)n((G4S)n)的连接体与任一个IgGl重链的C端残基连接；其中n是至少为2的整数；并且其中每个scFv结构域具有N端‑可变重链结构域‑接头‑可变轻链结构域‑C端或N端‑可变轻链结构域‑接头‑可变重链结构域‑C端的结构顺序，并且其中所述接头可以由(gly‑gly‑gly‑gly‑ser)m((G4S)m)氨基酸序列组成。其中m是至少为3的整数。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.22 US 62/095,3481.一种双特异性四价抗体，所述双特异性四价抗体包含：两条IgGl重链；两条kappa轻链；以及两个单链Fv(scFv)结构域。其中所述两条IgGl重链和kappa轻链形成对HER2的第一结构域具有结合特异性的IgG部分；其中所述两个scFv结构域对HER2的第二结构域具有结合特异性，并且每个scFv结构域通过具有氨基酸序列(gly-gly-gly-gly-ser)n((G4S)n)的连接体与任一个IgGl重链的C端残基连接；其中n是至少为2的整数；并且其中每个scFv结构域具有N端-可变重链结构域-接头-可变轻链结构域-C端或N端-可变轻链结构域-接头-可变重链结构域-C端的结构顺序，并且其中所述接头可以由(gly-gly-gly-gly-ser)m((G4S)m)氨基酸序列组成。其中m是至少为3的整数。2.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，n为小于20的整数。3.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，n为1至15的整数。4.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，n为1至9的整数。5.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，m为小于10的整数。6.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，m为小于7的整数。7.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，m为3、4、5或6。8.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，所述IgGl重链中的至少一个是人源化的或人IgGl重链。9.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，两条IgGl重链是人源化的或人IgGl重链。10.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，所述kappa轻链中的至少一个是人源化的或人kappa轻链。11.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，两条kappa轻链是人源化的或人kappa轻链。12.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，HER2的所述第一或所述第二结构域独立地选自HER2的结构域2和结构域4。13.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，所述IgG部分对HER2的结构域2具有结合特异性。14.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，所述scFv结构域对HER2的结构域4具有结合特异性。15.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，所述IgG部分对HER2的结构域2具有结合特异性，并且同时所述scFv结构域对HER2的结构域4具有结合特异性。16.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，所述IgG部分对HER2的结构域4具有结合特异性。17.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，所述scFv结构域对HER2的结构域2具有结合特异性。18.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，所述IgG部分对HER2的结构域4具有结合特异性，并且同时所述scFv结构域对HER2的结构域2具有结合特异性。19.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，所述IgGl重链中的至少一个包含选自SEQIDNO7、15、30、40、50和58的氨基酸序列。20.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，所述IgGl重链、连接体以及scFv结构域具有选自SEQIDNO：30、50、40和58的氨基酸序列。21.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，所述kappa轻链中的至少一个包含选自SEQIDNO3、11、25、35、45和53的氨基酸序列。22.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，可变轻链中的至少一个包含选自SEQIDNO4、12、26、36、46和54的氨基酸序列。23.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，可变重链中的至少一个包含选自SEQIDNO8、16、31、41、79和59的氨基酸序列。24.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，scFv结构域中的至少一个包含选自SEQIDNO19、22、32、42、60、63、66、69、72、75、78和80的氨基酸序列。25.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，所述IgG部分对HER2的结构域2具有结合特异性，并且所述scFv结构域对HER2的结构域4具有结合特异性；其中所述IgGl重链、连接体以及scFv结构域具有SEQIDNO30的氨基酸序列，并且所述kappa轻链具有SEQIDNO25的氨基酸序列。26.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，所述IgG部分对HER2的结构域2具有结合特异性，并且所述scFv结构域对HER2的结构域4具有结合特异性；其中所述IgGl重链、连接体以及scFv结构域具有SEQIDNO50的氨基酸序列，并且所述kappa轻链具有SEQIDNO45的氨基酸序列。27.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中，所述IgG部分对HER2的结构域4具有结合特异性，并且所述scFv结构域对HER2的结构域2具有结合特异性；其中所述IgGl重链、连接体以及scFv结构域具有SEQIDNO40的氨基酸序列，并且所述kappa轻链具有SEQIDNO35的氨基酸序列。28....

【专利技术属性】
技术研发人员：高泽人，朱义，菲尔·谭，布莱尔·伦肖，布莱恩·科瓦切维奇，
申请(专利权)人：西雅图免疫公司，
类型：发明
国别省市：美国,US