包含内部标记引物的核酸的测序、扩增和检测方法技术

本申请涉及包含内部标记引物的核酸的测序、扩增和检测方法。更具体而言，本申请提供了用于核酸测序或扩增和检测的改进方法，所述方法包括：i)提供至少一种核酸引物，其包含至少一个标记的核苷酸，ii)提供酶和试剂，其使用所述至少一种标记的核酸引物来扩增靶核酸的，iii)将反应组分在适合于靶核酸引物的扩增的条件下温育，iv)通过标记的核苷酸检测扩增的核酸，其中所述核酸引物包含下列序列：5’‑NaXNb‑3’，其中N是任意核苷酸，其中“a”和“b”表示核苷酸数量，并且在1至150的范围内，并且其中X是所述至少一个标记的核苷酸。此外，本文还公开了包含这样的核酸引物的试剂盒，以及所述试剂盒或核酸引物在用于核酸测序或扩增和检测的方法中的用途。

Nucleic acid sequencing, amplification and detection methods comprising an internal marker primer

The present application relates to nucleic acid sequencing, amplification and detection methods comprising an internal marker primer. More specifically, the invention provides improved methods for nucleic acid sequencing or amplification and detection, the method comprises the following steps: I) providing at least one nucleic acid primers, nucleotides comprising at least one marker, II) provide enzymes and reagents, nucleic acid primers using the at least one marker for amplification of target nucleic acid, III) reaction components in conditions suitable for amplification of target nucleic acid primers were incubated under IV) labeled nucleic acids by nucleotide amplification, wherein the nucleic acid primer contains the following sequence: 5 \NaXNb 3\, where N is any nucleotide, including \a\ and \B said the number of nucleotides, and in the range of 1 to 150, and X is one of the at least one nucleotide marker. In addition, kits comprising such nucleic acid primers, and the use of said kits or nucleic acid primers in nucleic acid sequencing or amplification and detection are also disclosed.

【技术实现步骤摘要】
包含内部标记引物的核酸的测序、扩增和检测方法本申请为国际申请日2012年5月4日、国际申请号PCT/EP2012/058259于2013年11月6日进入中国国家阶段、申请号201280022096.0、专利技术名称“包含内部标记引物的核酸的测序、扩增和检测方法”的分案申请。
本专利技术属于生物学和化学领域，特别是分子生物学领域。更具体来说，本专利技术涉及用于核酸测序或扩增和检测的方法和试剂盒。
技术介绍
如今，分子方法在诊断学和鉴定个体，例如在法医学领域或亲子鉴定中发挥重要作用。靶区域的扩增是这些方法中的中心程序。此外，方法包括在大多数情况下通过凝胶电泳如毛细管电泳来分析被扩增靶区域的长度。被扩增材料的分析通过荧光标记物的检测来进行。将标记物附连到用于扩增的位点特异性引物的5’-末端。然而，当分析扩增产物时，小的干扰性人为峰、即所谓的“染料污迹(dyeblobs)”的出现，导致基线具有高的“背景噪音”，这干扰了方法的灵敏度。“染料污迹”是电泳图中不代表特异性扩增产物，而是代表包含标记物的降解产物的峰。造成它们的分子是游离的荧光染料标记物以及与标记物相连的1-8bp长的寡核苷酸。后者可本文档来自技高网...

【技术保护点】
内部标记的核酸引物在减少染料污迹中的应用，其中所述核酸引物用于包括下列步骤的扩增方法：i)提供至少一种核酸引物，其包含至少一个标记的核苷酸，ii)提供没有外切酶活性的DNA聚合酶和试剂，使用所述至少一种标记的核酸引物来扩增靶核酸，iii)将反应组分在适合于靶核酸引物扩增的条件下温育，iv)通过标记的核苷酸来检测扩增的核酸，其中所述核酸引物包含下列序列：5’‑NaXNb‑3’，其中N可以是任意核苷酸，其中“a”和“b”表示核苷酸的数量并且可以在1至150的范围内，其中“a”和“b”相差5或更小，并且其中X是所述至少一个标记的核苷酸。

【技术特征摘要】
2011.05.06 EP 11165142.81.内部标记的核酸引物在减少染料污迹中的应用，其中所述核酸引物用于包括下列步骤的扩增方法：i)提供至少一种核酸引物，其包含至少一个标记的核苷酸，ii)提供没有外切酶活性的DNA聚合酶和试剂，使用所述至少一种标记的核酸引物来扩增靶核酸，iii)将反应组分在适合于靶核酸引物扩增的条件下温育，iv)通过标记的核苷酸来检测扩增的核酸，其中所述核酸引物包含下列序列：5’-NaXNb-3’，其中N可以是任意核苷酸，其中“a”和“b”表示核苷酸的数量并且可以在1至150的范围内，其中“a”和“b”相差5或更小，并且其中X是所述至少一个标记的核苷酸。2.内部标记的核酸引物在减少扩增方法中出现的染料污迹中的应用，所述扩增方法包括下列步骤：i)提供至少一种核酸引物，其包含至少一个标记的核苷酸，ii)提供酶和试剂，使用所述至少一种标记的核酸引物来扩增靶核酸，iii)将反应组分在适合于靶核酸引物扩增的条件下温育，iv)通过标记的核苷酸来检测扩增的核酸，其中所述核酸引物包含下列序列：5’-NaXNb-3’，其中N可以是任意核苷酸，其中“a”和“b”表示核苷酸的数量并且可以在1至150的范围内，其中“a”和“b”相差5或更小，并且其中X是所述至少一个标记的核苷酸。3.权利要求1或2的应用，其中步骤iv)包括按照大小分离所述扩增的核酸的步骤。4.权利要求1或2的应用，其中标记物通过核苷酸的环外氨基或2'-氨基连接到所述核苷酸。5.权利要求1或2的应用，其中“a”在3至25之间。6.权利要求1或2的应用，其中“b”在3至25之间。7.权利要求1或2的应用，其中“a”和“b”具有相同的值和/或为10。8.权利要求1或2的应用，其中所述核酸引物具有10至300nt的长度。9.权利要求1或2的应用，其中标记物选自由荧光团、生色团、放射性同位素和化学发光物构成的标记物组，并且所述荧光团组包含5-或6-羧基荧光素(FAMTM)、VICTM、NEDTM、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如CY3TM、CY5TM、CY3.5TM、CY5.5TM、Cy7TM、氧杂蒽、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-1,4-二氯-2’,7’-二氯-荧光素6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOETM)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRATM)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、罗丹明BODIPY染料例如BODIPYTMR、俄勒冈绿、香豆素类例如伞形酮、苯甲酰亚胺类例如Hoechst33258、菲啶类例如雅吉瓦黄、Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa500、Alexa514、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa610、Alexa633、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa750、溴化乙锭、吖啶染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料、Atto390、Atto425、Atto465、Atto488、Atto495、Atto520、Atto532、Atto550、Atto565、Atto590、Atto594、Atto620、Atto633、Atto647N、Atto655、AttoRhoG6、AttoRho11、AttoRho12、AttoRho101、BMNTM-5、BMNTM-6、CEQ8000D2、CEQ8000D3、CEQ8000D4、DY-480XL、DY-485XL、DY-495、DY-505、DY-510XL、DY-521XL、DY-521XL、DY-530、DY-547、DY-550、DY-555、DY-610、DY-615、DY-630、DY-631、DY-633、DY-635、DY-647、DY-651、DY-675、DY-676、DY-680、DY-681、DY-700、DY-701、DY-730、DY-731、DY-732、DY-750、DY-751、DY-776、DY-780、DY-781、DY-782、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)、TETTM、CALGold540、CALFluorRED590、CALFluorRed610、CALFluorRed635、700Dx、800CW、MarinaPacific6-(4,7-二氯-2',7'-二苯基-3',6'-二特戊酰荧光素-6-甲酰胺基)-己基-1-O-(2-氰基乙基)-(N,...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗兰切斯卡·迪帕斯奎尔，丹尼尔·米勒，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE