结核快速诊断试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种结核快速诊断试剂盒，其包括有特异性结核刺激抗原和试纸条，所述试纸条由样品垫、荧光垫、包被膜、和吸水纸顺次搭接设置在底板上构成，所述荧光垫上结合有荧光微球，该荧光微球偶联有r‑干扰素结合抗体，所述包被膜上包被有r‑干扰素单克隆捕获抗体；所述特异性结核刺激抗原有11条氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.11所示的肽段。

Rapid diagnostic kit for tuberculosis and method for preparing the same

The invention discloses a tuberculosis rapid diagnostic kit, which comprises a specific antigen and tuberculosis test strip, the strip consists of a sample pad, pad, fluorescent coating film, and absorbent paper which is arranged on the bottom plate are overlapped, the fluorescent mat combined with fluorescent microspheres, the fluorescent microsphere coupling r interferon antibody, the coating film is coated with R interferon monoclonal capture antibody; the specific stimulation of tuberculosis antigen has 11 amino acid sequence respectively as peptide SEQ ID NO.1 SEQ ID is shown in NO.11.

【技术实现步骤摘要】
结核快速诊断试剂盒及其制备方法
本专利技术属于医学检测领域，具体的是涉及一种结核快速诊断试剂盒及其制备方法。
技术介绍
目前结核检测技术分为四类：一、痰涂片，技术简单，收费便宜，是筛查的主要手段，但是其阳性率低，不能区分结核分枝杆菌和非典型结核分枝杆菌，使其临床意义受到限制；二、基于特异性抗原抗体的免疫学检测方法，此类方法操作简单，但是特异性和敏感性都不好，使其在临床推广中收到限制；三、基于结核分枝杆菌DNA的核酸扩增检测方法，不管是普通PCR扩增还是等温扩增方法，其检测原理是通过特异性的引物检测样本(通常为痰液、胸水、肺冲洗液)中结核分枝杆菌的核酸。此类基于PCR的检测方法，敏感度和特异性都比较高，但是需要专业的分子实验室且检测成本相对较高、只能检测肺部结核，也限制了临床的推广；四、基于细胞免疫介导结核菌r-干扰素释放的检测试剂盒，目前比较有代表性的是T细胞斑点免疫法(T-SPOT)和凯杰公司推出的QuantiFERON-TB试剂盒，这两种试剂盒在检测的灵敏度和特异性方面，都达到了比较高的水平，但是价格十分昂贵，很难作为普筛推广。我国是结核大国，结核病也被列入国家重大传染病行列，是我们重点防治对象。目前使用的结核筛查方法，都有着不同方面的缺陷。因此，新的筛查方法的开发对结核病的防治，以及提高我国医疗卫生水平有着重大的现实意义。、
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种结核快速诊断试剂盒，该试纸条具有特异性高的优点。一种结核快速诊断试剂盒，包括有特异性结核刺激抗原和试纸条，所述试纸条由样品垫、荧光垫、包被膜、和吸水纸顺次搭接设置在底板上构成，所述荧光垫上结合有荧光微球，该荧光微球偶联有r-干扰素结合抗体，所述包被膜上包被有r-干扰素单克隆捕获抗体；所述特异性结核刺激抗原为:氨基酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.11所示的肽段。本专利技术的另一个目的是提供一种特异性结核刺激抗原。具体技术方案如下。一种特异性结核刺激抗原，选取结核分枝杆菌特异性抗原表达区域，在体外合成结核特异性多肽片段共11条。这些合成的多肽片段作为结核特异性的刺激抗原，用来刺激待测细胞。所述特异性结核刺激抗原有11条氨基酸序列分别如SEQIDNO.1-SEQIDNO.11所示的肽段。本专利技术的另一个目的是提供一种结核快速诊断试纸条。具体技术方案如下。一种结核快速诊断试纸条，所述试纸条由样品垫、荧光垫、包被膜、和吸水纸顺次搭接设置在底板上构成，所述荧光垫上结合有荧光微球，该荧光微球偶联有r-干扰素结合抗体，所述包被膜上包被有r-干扰素单克隆捕获抗体。本专利技术的另一个目的是提供上述结核快速诊断试纸条的制备方法。实现上述目的的技术方案如下。上述结核快速诊断试纸条的制备方法，包括以下步骤：IV)制备包被膜：将0.4-0.6mg/ml的浓度的r-干扰素单克隆捕获抗体，以0.8-1微升每厘米硝酸纤维素膜喷到硝酸纤维素膜上干燥，切条，得到包被膜备用；V)制备荧光垫：将r-干扰素结合抗体偶联到荧光微球上，再将偶联有抗体的荧光微球喷在结合垫上，干燥，切条，得到荧光垫备用；VI)将准备好的样品垫、结合垫、包被膜、和吸水纸顺次搭接设置在底板上，即得所述结核快速诊断试纸条。在其中一个实施例中，步骤Ⅱ)中，以90-110ng/ul的浓度r-干扰素结合抗体，使用羧基-氨基共价结合的方式偶联到荧光微球上(微球的浓度为0.8-1.2mg/ml，荧光微球与r-干扰素结合抗体的质量比为9—11：1。步骤Ⅱ)中，将偶联有抗体的荧光微球以6-10微升每cm结合垫的量喷在结合垫上。本专利技术主要具有以下优点：1)本专利技术的合成的多肽抗原为短的多肽片段(11-21AA)，其免疫源性大大增加，提高了刺激效率，且对比融合全长抗原或天然抗原，成本较低。2)特异性的抗原多肽，消除了卡介苗和非典型分枝杆菌的影响，检测特异性大大提高。3)特殊的时间分辨r-干扰素快速检测方法，从加样到检测可以在10分钟内完成，手工操作时间仅为10秒钟，大大提高了检测效率和临床劳动强度，也使高通量筛查成为可能。附图说明图1为本专利技术的结核快速诊断试纸条的示意图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。本专利技术的一个实施中，涉及到一种快速的r-干扰素检测方法(见图1)：当将含有IFN-γ的样品滴在加样区，待测样品中的抗原(抗体)与结合垫中的荧光纳米微球标记的抗体合并通过毛细作用向前层析，当达到检测区后，与检测线上固定的抗体合，形成微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线上，而多余的荧光微球标记物继续向前层析，与固定在质控线二抗结合。反应结束后，用紫外光源(365nm)对检测区扫描检测，检测线和质控线上荧光纳米微球发出高强度的荧光(615nm)，且衰变时间也较长。利用延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光全部衰变后，再测量微球的特异性荧光，这样就可以完全排除特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。本实施例中，所述结核快速诊断试剂盒结核快速诊断试剂盒，包括有特异性结核刺激抗原和试纸条，其制备方法和检测如下所述。1)特异性结核刺激抗原多肽片段:TEQQWNFAGIEAAASA(SEQIDNO.1)；IEAAASAIQGNVTS(SEQIDNO.2)；AIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKL(SEQIDNO.3)；QSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQ(SEQIDNO.4)；GSEAYQGVQQKWDATATELNNA(SEQIDNO.5)；NFERISGDLKTQIDQVESTAGSL(SEQIDNO.6)；QVESTAGSLQGQWRGAAGTMQ(SEQIDNO.7)；RQAGVQYSRADEEQQQALSS(SEQIDNO.8)；LFAATAAAAAAVDRGDPP(SEQIDNO.9)；ASAAALAGDAAGAWR(SEQIDNO.10)；MSGHALAARTLLAAA(SEQIDNO.11)。2)首先合成上述片段的多肽，纯度需大于85％。其次，将11种多肽片段等比混合后，先加入DMSO(二甲基亚砜)溶解(每50mg多肽加入100ulDMSO)，然后用无内毒素的DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)稀释成5mg/ml的溶液备用，储存于-20摄氏度备用。用时取肝素锂抗凝全血1ml，加入上述抗原混合液5ul,于37摄氏度过夜培养，分离血浆待检。3)全血细胞刺激实验：试用肝素锂抗凝的采血管，取至少3.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核快速诊断试剂盒，其特征在于，包括有特异性结核刺激抗原和试纸条，所述试纸条由样品垫、荧光垫、包被膜、和吸水纸顺次搭接设置在底板上构成，所述荧光垫上结合有荧光微球，该荧光微球偶联有r‑干扰素结合抗体，所述包被膜上包被有r‑干扰素单克隆捕获抗体；所述特异性结核刺激抗原有11条氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.11所示的肽段。

【技术特征摘要】
1.一种结核快速诊断试剂盒，其特征在于，包括有特异性结核刺激抗原和试纸条，所述试纸条由样品垫、荧光垫、包被膜、和吸水纸顺次搭接设置在底板上构成，所述荧光垫上结合有荧光微球，该荧光微球偶联有r-干扰素结合抗体，所述包被膜上包被有r-干扰素单克隆捕获抗体；所述特异性结核刺激抗原有11条氨基酸序列分别如SEQIDNO.1-SEQIDNO.11所示的肽段。2.根据权利要求1所述的结核快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试纸条中的包被膜的制备方法为：将0.4-0.6mg/ml的浓度的r-干扰素单克隆捕获抗体，以0.8-1微升每厘米硝酸纤维素膜喷到硝酸纤维素膜上干燥，切条，得到包被膜。3.根据权利要求1或2所述的结核快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试纸条中的荧光垫的制备方法为：将r-干扰素结合抗体应用羧基-氨基共价结合的方式偶联到荧光微球上，所述r-干扰素结合抗体的浓度为90-110ng/ul，荧光微球的浓度为0.8-1.2mg/ml，荧光微球与r-干扰素结合抗体的质量比为9—11：1；将偶联有抗体的荧光微球以6-10微升每cm结合垫的量喷在结合垫上，即得。4.一种特异性结核刺激抗原，其特征在于，其为氨基酸序列分别如SEQIDNO.1-SEQIDNO.11所示的肽段。5.一种结核快速诊断试纸条，其特征在于，所述试纸条由样品垫、荧光垫、包被膜、和吸水纸顺次搭接设置在底板上构成，所述荧光垫上结合有荧光微球，该荧光微球偶联有r-干扰素结合抗体，所述包被膜上包被有r-干扰素单克...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨祥胜，
申请(专利权)人：广州市宝创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44