X‑连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及医学诊断技术领域，具体而言，涉及一种X‑连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒及其应用。所述试剂盒包括：抗人CD3、CD56、CD8a、SAP的流式荧光抗体、所述抗人SAP的流式荧光抗体的同型对照荧光抗体、抗人SAP的Western Blot抗体以及所述抗人SAP的Western Blot抗体对应的二抗。基于该诊断试剂盒的检测CTL和NK细胞中SAP蛋白丰度的方法，检测快速，通量大，准确度高，且人为因素影响较小。

【技术实现步骤摘要】
X-连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒及其应用
本专利技术涉及医学诊断
，具体而言，涉及一种X-连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒及其应用。
技术介绍
SAP(SLAMassociatedprotein)蛋白是小分子的接头蛋白，有一个SH2域，在介导淋巴细胞的激活分子(SLAM)家族的信号受体中起了重要的信号转导作用。SAP蛋白作为细胞液内的信号转接器和调控开关，通过和SLAM相关因子的相互作用来调节机体的免疫细胞对EB病毒的反应。当SH2D1A基因发生突变，并影响遗传信息的转录和SAP蛋白表达时，就会改变SAP蛋白功能，这样通过SAP蛋白与SLAM家族的因子的作用关系，进一步影响免疫细胞的活化和抗病毒免疫信号的传递，使SAP蛋白不能正常的介导T/B细胞间相互作用，所以在EB病毒感染后，B淋巴细胞过度增生，而机体免疫系统却无法正常控制，最终导致临床上出现XLP相应的临床表现。X-连锁淋巴组织增殖综合征(X-linkedLymphProliferativeDisease，XLP)是一种少见的、常常是致死性的原发性免疫缺陷病，可由EB病毒(Epstein–Barrvirus，EBV)感染诱发，表现为爆发性传染性单核细胞增多症、丙种球蛋白异常血症和淋巴增殖性疾病以及淋巴瘤。X-连锁淋巴增殖综合征包括XLP-1和XLP-2，以X连锁隐性方式遗传，多见于男性。本病主要由编码淋巴信号活化分子相关蛋白(SAP)、X-连锁凋亡抑制因子(XIAP)和IL-2诱导的T细胞激酶(ITK)基因的突变引起，基因序列分析是确诊XLP的依据；SAP、XIAP、ITK蛋白的表达也可以作为筛查XLP的手段。家族史是需要考虑的主要客观指标，其他诊断标准包括患儿的临床表现、EB病毒感染后的EBNA抗体检测等。XLP-1由位于X染色体上的编码T细胞、NK，NKT细胞SAP蛋白的SH2D1A基因突变所致。被EBV感染的B细胞(B-EBV)可招募SAP蛋白及传递激活信号，从而消除B-EBV；当SH2DIA基因突变导致SAP蛋白量减少或结构改变影响功能时，就会导致淋巴细胞对EBV应答中发生无限制增殖，并且出现NK细胞功能障碍。目前存在多种SAP蛋白的检测方法，其中靶细胞的选择，结果的确证，等问题是
的核心问题，是决定检测结果是否理想的关键。目前尚缺乏统一规范的操作流程。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种X-连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒以及使用该试剂盒检测SAP蛋白丰度的检测方法，所述的检测方法可解决现有技术检测速度慢、精度较低、准确性较差、检测结果容易受到检测者的主观因素影响等问题。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种X-连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒，所述试剂盒包括：抗人CD3、CD56、CD8a、SAP的流式荧光抗体、所述抗人SAP的流式荧光抗体的同型对照荧光抗体、抗人SAP的WesternBlot抗体以及所述抗人SAP的WesternBlot抗体对应的二抗。优选的，抗人CD3、CD56、CD8a、SAP的流式荧光抗体分别购自4abio公司、eBioscience公司、eBioscience公司、eBioscience公司，货号分别为FHF003-100、17-0566-42、45-0088-42、#12-9787-42；优选的，所述抗人SAP的流式荧光抗体的同型对照荧光抗体购自Abcam，货号为#ab109120；优选的，所述抗人SAP的WesternBlot抗体购自Abcam，货号为#ab97051。优选的，如上所述的试剂盒，所述流式荧光抗体所带的荧光标记包括：FITC、Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa555、Alexa647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、CascadeBlue、Cy2、Cy3、Cy5、CY5.5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、OregonGreen488、OregonGreen500、OregonGreen514、PacificBlue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、LaJolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyaninB、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明异硫醇、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的多种。优选的，如上所述的试剂盒，所述抗人CD3、CD56、CD8a、SAP的流式荧光抗体以及所述同型对照荧光抗体上所带有的荧光标记依次为FITC、APC、PercpCy5.5、PE、PE。优选的，如上所述的试剂盒，所述试剂盒中还包括抗凝剂、细胞固定剂、细胞破膜剂、流式染色缓冲液、蛋白裂解液中的一种或多种；更优选的，所述抗凝剂选自EDTA、肝素、枸橼酸盐和草酸盐中的一种或多种；更优选的，所述细胞固定剂购自eBioscience，货号#00-5521-00；更优选的，所述细胞破膜剂购自eBioscience，货号#00-8333-56；更优选的，所述流式缓冲液的配方为：含有1.8％～2.2％FBS和1.8mM～2.2mMEDTA的1×PBS溶液。更优选的，所述蛋白裂解液为RIPA。如上任一项所述的试剂盒在制备诊断X-连锁淋巴组织增殖综合征的产品中的应用；优选的，如上任一项所述的试剂盒在制备诊断1型X-连锁淋巴组织增殖综合征的产品中的应用。优选的，如上所述的应用，应用时对待检样本进行的预处理步骤包括：1)、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度；2)、向步骤1)中的细胞中同时加入抗人CD3、CD56、CD8a的流式荧光抗体并孵育；3)、离心，将沉淀与细胞固定剂共孵育；4)、离心，将沉淀与细胞破膜剂共孵育；5)、离心，用流式缓冲液洗涤沉淀后重悬；6)、将重悬后的样品分为两组，分别加入抗人SAP的流式荧光抗体和同型对照荧光抗体并孵育；7)、离心，用流式缓冲液洗涤沉淀后重悬；和/或；a)、分离待检样本中的外周血单个核细胞并用蛋白裂解液裂解收集蛋白；b)、将蛋白使用所述抗人SAP的WesternBlot抗体以及所述抗人SAP的WesternBlot抗体对应的二抗进行WesternBlot实验，读取所得条带的灰度值或荧光值；其中步骤1)～7)与步骤a)～b)没先后顺序。优选的，如上所述的应用，在步骤1)中，所述细胞浓度为3.5～4.5×106/ml；还可以选择4×106/ml。优选的，如上所述的应用，在步骤2)中，孵育条件为：室温避光孵育15～25min；还可以选择孵育20min。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种X‑连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：抗人CD3、CD56、CD8a、SAP的流式荧光抗体、所述抗人SAP的流式荧光抗体的同型对照荧光抗体、抗人SAP的Western Blot抗体以及所述抗人SAP的Western Blot抗体对应的二抗。

【技术特征摘要】
1.一种X-连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：抗人CD3、CD56、CD8a、SAP的流式荧光抗体、所述抗人SAP的流式荧光抗体的同型对照荧光抗体、抗人SAP的WesternBlot抗体以及所述抗人SAP的WesternBlot抗体对应的二抗。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人CD3、CD56、CD8a、SAP的流式荧光抗体以及所述同型对照荧光抗体上所带有的荧光标记依次为FITC、APC、PercpCy5.5、PE、PE。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括抗凝剂、细胞固定剂、细胞破膜剂、流式缓冲液、蛋白裂解液中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述流式缓冲液的配方为：含有1.8％～2.2％FBS和1.8mM～2.2mMEDTA的1×PBS溶液。5.权利要求1～4任一项所述的试剂盒在制备诊断X-连锁淋巴组织增殖综合征的产品中的应用。6.一种使用权利要求1～4任一项所述的试剂盒检测CTL和NK细胞中SAP蛋白丰度的方法，其特征在于，包括：1).分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度；2).向步骤1)中的细胞中同时加入抗人CD3、CD56、CD8a的流式荧光抗体并孵育；3).离心，将沉淀与细胞固定剂共孵育；4).离心，将沉...

【专利技术属性】
技术研发人员：王昭，高卓，张嘉，王旖旎，王晶石，吴林，赖雯苑，金志丽，孟硕，宋悦，崔婷婷，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京友谊医院，
类型：发明
国别省市：北京,11