一种膜蛋白检测制剂、非标记肿瘤纳米探针及使用方法技术

本发明专利技术公开了一种膜蛋白检测制剂及使用方法。利用细胞膜蛋白引发的包含丰富胞嘧啶(C‑rich)的单链DNA(ssDNA)的核酸序列，随后将银纳米簇(AgNCs)从聚丙烯酸(PAA)框架上转移到C‑rich DNA序列上，形成一种稳定的高量子产量的具有荧光特性的ssDNA‑AgNCs。此外，本发明专利技术还同时公开了非标记肿瘤纳米探针及其制备方法。该制剂的制备方法简单，反应条件温和、成本低，符合绿色化学的理念。使用该制剂能够敏感、快速、简单检测膜蛋白，而且检测限很低，能够定量分析检测膜蛋白，在医学研究和和一些疾病的临床早期诊断方面具有潜在的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种膜蛋白检测制剂、非标记肿瘤纳米探针及使用方法
本专利技术属于膜蛋白检测
；具体涉及一种基于膜蛋白能够引起C-rich的释放，通过银纳米簇从聚丙烯酸(PAA)框架上转移到C-richDNA序列上的非标记原位膜蛋白检测制剂、非标记肿瘤纳米探针及它们的使用方法。
技术介绍
膜蛋白是生物膜中所含有的蛋白，是生物膜的主要功能承担者，在生物生理功能中占有举足轻重的作用。由于膜蛋白特殊的功能性质，使得膜蛋白一旦发生变化，就会导致人类许多疾病的发生。例如，细胞膜上面的某些膜蛋白发生变化，就会导致正常细胞的生理功能发生紊乱，有可能会导致正常细胞转换成恶性肿瘤细胞。而由于膜蛋白在细胞表面，很容易与外界分子接触，因此在许多的生物工程中，膜蛋白被用来当作药物靶点，或者用于标记肿瘤细胞，也因此在肿瘤临床治疗上具有非常良好的应用前景。然而，许多的技术尽管能够进行敏感准确地完成膜蛋白检测，但是这些技术通常需要分离、净化等繁琐的预处理过程，以达到膜蛋白原位检测的目的。目前，有许多利用核酸适配体技术进行原位检测膜蛋白的方法。核酸适配体通常是一小部分的DNA、RNA、XNA或者肽，是一种抗体类似物，它能够与多种生物分子高特异性、高选择性地结合，而且其尺寸小，具有更好的组织穿透能力，因此被广泛用于生物传感器领域。但是，单纯的只是利用核酸适配体技术进行原位检测膜蛋白也有一些缺点，比如说目标膜蛋白需要具有荧光特性的荧光染料标记之后，而这种利用化学物质标记的方法需要精密的仪器和受过训练的专业人员人员进行操作检测，这就增大了膜蛋白检测的成本。银纳米簇(AgNCs)由于具有很强的量子限制效应和小尺寸效应，表现出理想的光学和电学性能，从而成为纳米材料研究领域的热点之一。相较于有机染料荧光染料易漂白的性质，银纳米簇发光颜色随团簇尺寸可调，并且能够在非常温和的条件下就能合成，其作为一种潜在的荧光标记物，有望应用于光成像、生物标记、化学传感器等领域。由于AgNCs本身具有的量子限制效应，使得其与胞嘧啶能够稳定结合，AgNCs就能与原来的模板发生剥离，进而与富含胞嘧啶的单链(C-rich)DNA序列结合。
技术实现思路
为解决现有检测膜蛋白方法的步骤繁琐及造价高的问题，本专利技术提供了一种基于膜蛋白引发C-rich序列的释放，接着利用将AgNCs从原有模板转移到C-rich序列上，从而达到无需标记就能实现原位检测膜蛋白的制剂。旨在提高原位检测膜蛋白的灵敏度，降低实验成本，简化实验步骤。一种膜蛋白检测制剂，包括：聚丙烯酸(PAA)保护的AgNCs、由核酸适配子和富含胞嘧啶的单链(C-rich序列)杂合形成的双链DNA。所述的聚丙烯酸(PAA)保护的AgNCs实际上是由聚丙烯酸与硝酸银溶液混合反应得到，加入适量的硼氢化钠还原溶液中的银离子，终产物中聚丙烯酸与AgNCs紧密结合，且用于检测时能提供足够的AgNCs与C-rich序列结合；反应完成后离心洗涤，透析以去除硼氢化钠和多余银离子。作为进一步的优选，所述的膜蛋白是酪激酶-7(PTK7)，这种膜蛋白通常被用作T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞的标记物以及受体。而且本专利技术仅限于检测膜蛋白，因为如：BSA、HAS和Fn蛋白均不能与Ag特异性结合产生荧光。只选C-rich序列与适配子杂合，而不是A-rich、G-rich和T-rich，源于Ag与胞嘧啶的结合能力要强于其他三种脱氧核糖。选用的C-rich序列中胞嘧啶的含量对于DNA-AgNCs的荧光强度影响很大，原因是由于胞嘧啶中的N3能与Ag原子的结合，一定程度下，含有数量愈多，结合能力愈大。选用的C-rich序列中胞嘧啶的位置对于DNA-AgNCs的荧光强度影响很大，一味的增大胞嘧啶数目并不能持续地增大荧光强度，原因在于，胞嘧啶的位置也即胞嘧啶之间的间隙也会对荧光强度产生很大影响。作为进一步的优选，所述的富含胞嘧啶的单链的胞嘧啶数目占30％以上。作为进一步的优选，所述的富含胞嘧啶的单链每3个胞嘧啶之间间隔至少一个其他的脱氧核糖。会增大荧光强度，原因是Ag与胞嘧啶之间的位阻效应。作为进一步的优选，所述的核酸适配子为sgc8，序列为：5’-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3’；富含胞嘧啶的单链为S16，序列为5’-TCTAACCCTCCCTCCCGTACAG-3’。本专利技术的第二个目的是提供非标记肿瘤纳米探针，该探针即上述的由核酸适配子和富含胞嘧啶的单链(C-rich序列)杂合形成的双链DNA。本专利技术的第三个目的是提供所述的膜蛋白检测制剂的使用方法，选用聚丙烯酸保护的AgNCs、由核酸适配子和富含胞嘧啶的单链杂合形成的双链DNA混合，其中适配子能够与膜蛋白强力结合，导致DNA双螺旋构象的改变，从而导致富含胞嘧啶的单链释放，接着富含胞嘧啶的单链与聚丙烯酸框架上面的AgNCs强力结合，导致纳米粒子的荧光强度放大。作为进一步的优选，膜蛋白检测体系中，pH取值为5.5-6.0，优选5.5；温度在40-50℃优选45℃；反应时间3.5-8分钟，优选4-6分钟；膜蛋白PTK7的检测范围从30pM-2nM，最小检测限为12pM。pH能够影响AgNCs转运效率，pH低于4.5时，未发生AgNCs转移到DNA反应，随着pH的增大，转移效率逐渐增大，直到pH增加到5.5，此时荧光强度最大，pH大于6时，AgNCs转运效率明显减小。温度能够影响AgNCs转运效率，温度变化范围在25-45℃时，转移效率逐渐增大，荧光强度。温度再增加时，AgNCs转运效率逐渐减小。作为进一步的优选，膜蛋白检测中，在加入DNA之后的第4min开始选作传输时间(传输时间是指AgNCs与PAA分离，进而与DNA单链结合的时间)。在加入DNA之后的第4min荧光强度迅速增加，因此可以选作最优传输时间。作为进一步的优选，膜蛋白检测中，膜蛋白PTK7的检测范围从30pM-2nM，最小检测限为12pM。本专利技术与其他依赖人工与仪器的复杂的检测方法相比，利用该方法能够灵敏快速准确的进行膜蛋白的检测，而且能够定量测量膜蛋白，这使得该方法在一些疾病的研究以及临床诊断上具有良好的应用前景。附图说明图1A和B分别为激发波长在470nm激发和550nm荧光发射光谱，实线曲线代表PAA-AgNCs，点画线曲线代表DNA-AgNCs。图2A黑色曲线代表PAA-AgNCs，曲线分别代表C12与G12、A12、T12、PAA-AgNCs结合后的荧光光谱图。B代表15组分别含有12个寡核苷酸，但由不同的胞嘧啶和胸腺嘧啶组合，不同数量及不同位点胞嘧啶下与AgNCs结合之后的荧光强度。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15柱状图分别代表S1、S2、S3、S4……S15与AgNCs结合之后的荧光强度，S1:5’-TTTTCCCCTTTT；S2:5’-TTTCCCCCCTTT；S3:5’-TTCCCCCCCCTT；S4:5’-TCCCCCCCCCCT；S5:5’-CCCCCCCCCCCC；S6:5’-TTCCTCCTCCTT；S7:5’-TTCCTTCCTTCC；S8:5’-CCTTTCCTTTCC；S9:5’-CCTTTTCCTTTTCC；S10:5’本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种膜蛋白检测制剂，其特征在于，包括：聚丙烯酸保护的AgNCs、由核酸适配子和富含胞嘧啶的单链杂合形成的双链DNA。

【技术特征摘要】
1.一种膜蛋白检测制剂，其特征在于，包括：聚丙烯酸保护的AgNCs、由核酸适配子和富含胞嘧啶的单链杂合形成的双链DNA。2.根据权利要求1所述的膜蛋白检测制剂，其特征在于，所述的富含胞嘧啶的单链的胞嘧啶数目占30％以上。3.根据权利要求1或2所述的膜蛋白检测制剂，其特征在于，所述的富含胞嘧啶的单链每3个胞嘧啶之间间隔至少一个其他的脱氧核糖。4.根据权利要求1所述的膜蛋白检测制剂，其特征在于，所述的膜蛋白是酪激酶-7；所述的核酸适配子为sgc8，序列为：5’-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3’；富含胞嘧啶的单链为S16，序列为5’-TCTAACCCTCCCTCCCGTACAG-3’。5.非标记肿瘤纳米探针，其特征在于，由核酸适配子和富含胞嘧啶的单链杂合形成的双链DNA。6.根据权利要求5所述的非标记肿瘤纳米探针，其特征在于，所述的富含胞嘧啶的单链的胞嘧啶数目占30％以上。7.根据权利要求5或6所述的非标记肿瘤纳米探针，其特征在于，所述的富含胞嘧啶的单链每3个胞嘧...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓留，刘珍军，陈万松，刘又年，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43