一种毕赤酵母高效表达重组PaDef抗菌肽的方法技术

本发明专利技术提供一种毕赤酵母中高效制备新型重组PaDef抗菌肽的方法。以毕赤酵母为宿主细胞，将抗菌肽PaDef的基因序列经过改造后(命名为mPaDef)插入到pPICZαA载体，并成功转入毕赤酵母GS115中，利用甲醇进行诱导表达，对表达产物进行纯化及活性鉴定。终产品是重组抗菌肽mPaDef的高表达菌株，发酵液上清中重组抗菌肽产量达84mg/L。本发明专利技术所制备重组抗菌肽具有广谱抗菌活性兼具良好的温度和蛋白酶稳定性，对弱酸性、中性及碱性环境的稳定性也较好。

Method for efficiently expressing recombinant PaDef antibacterial peptide by Pichia pastoris

The invention provides a method for efficiently preparing a novel recombinant PaDef antibacterial peptide in Pichia pastoris. In Pichia pastoris as host cells, the gene sequence of antibacterial peptide PaDef after transformation (named mPaDef) was inserted into the pPICZ alpha A vector and transferred into Pichia pastoris GS115, expression was induced by methanol, purification and activity identification of expression products. The final product is a high expression strain of recombinant antibacterial peptide mPaDef, and the recombinant antimicrobial peptide production in fermentation broth reaches 84mg/L. The recombinant antibacterial peptide prepared by the invention has broad spectrum antibacterial activity, good temperature and protease stability, and good stability to weak acid, neutral and alkaline environment.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗菌肽PaDef首次通过基因工程的方法在毕赤酵母中成功表达并且具有广谱抑菌活性，属于生物

技术介绍
抗菌肽是宿主非特异性免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体的肽类活性物质，是天然免疫的效应分子。近些年来，随着传统抗生素的大量使用，耐药细菌的出现，为人类的健康带来了巨大的隐患。抗菌肽具有广谱抗细菌、真菌、病毒、寄生虫的活性，且不易产生耐药菌株的优点。目前作为抗生素的替代品或者与抗生素协同作用有望成为新的抗菌药物。PaDef是从墨西哥鳄梨果实中分离得到，是典型的防御素类抗菌肽，与植物防御素的同源性高达80％，由45个氨基酸残基构成，分子量为7.5KDa，包含四对二硫键，分子内有α螺旋和β折叠结构。在牛内皮细胞BE-E6E7中表达的PaDef可以显著抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，但当细胞总蛋白浓度为100μg/mL时，对金黄色葡萄球菌的抑制率仅为52-65％，对大肠杆菌的抑制率仅>55％。目前获取抗菌肽的方法有三种：直接提取、化学合成以及基因合成法。然而，在大多数生物体内抗菌肽的浓度非常低，直接提取耗时且成本高。化学合成法也被认为不适合大规模生产。基因工程可以使外源抗菌肽基因在原核或者真核表达系统中表达，不仅节约成本而且可以用于大规模生产。而基因工程法有可分为原核表达系统和真核表达系统，原核表达系统缺乏转录后加工、折叠糖基化等功能，使得有些抗菌肽在原核表达系统中无抑菌活性。另外原核表达系统表达的蛋白为融合蛋白，须超声破碎，提高了生产成本。真核表达系统中若以细胞培养方式生产抗菌肽，需要的培养条件严格，仪器昂贵，而且培养基费用较高。故选择用毕赤酵母表达系统。毕赤酵母表达系统具有遗传操作方便、培养基成分简明和适合高密度发酵等优点；与原核表达系统相比，具有分泌表达和翻译后修饰的能力，因此许多在大肠杆菌中难以表达的重组蛋白在毕赤酵母中得以成功表达。另外，该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点：1.含有醇氧化酶启动子AOX1，这种启动子严格受甲醇调控；2.表达量高，毕赤酵母中外源基因都带有分泌信号肽α-factor，使外源目的蛋白分泌到培养液中，方便纯化；3.发酵工艺成熟，适合高密度发酵。4.遗传性状稳定,不会随着传代而丢失。5.能进行翻译后修饰，许多在原核表达系统中没有抑菌活性的抗菌肽，在毕赤酵母中成功表达，是因为毕赤酵母表达系统能对外源基因进行糖基化、蛋白磷酸化等翻译后修饰功能。故选择用毕赤酵母表达系统生产抗菌肽PaDef。本专利技术以毕赤酵母为表达载体，利用甲醇进行诱导表达，首次获得了高效表达抗菌肽PaDef的菌株，并经抑菌实验，确定其表达产物具有广谱抗菌活性和良好的温度、pH和蛋白酶稳定性。这使得PaDef抗菌肽在食品、农业、医药上都具有巨大应用潜力。本专利技术技术在国内外未见公开报道或使用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种毕赤酵母中高效制备重组PaDef抗菌肽的方法。技术方案概述如下：以毕赤酵母为宿主细胞，将抗菌肽PaDef的基因序列经过改造后(命名为mPaDef)插入到pPICZαA载体，并成功转入毕赤酵母GS115中，利用甲醇进行诱导表达，对表达产物进行纯化及活性鉴定。终产品是抗菌肽mPaDef的高表达菌株，发酵液上清中抗菌肽mPaDef产量达84mg/L。所制备重组抗菌肽具有广谱抗菌活性兼具良好的温度和蛋白酶稳定性，对弱酸性、中性及碱性环境的稳定性也较好。本专利技术的另一目的是提供一种PaDef抗菌肽经基因改造后的新型重组抗菌肽，命名为mPaDef，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。所述重组抗菌肽mPaDef的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。进一步地，本专利技术还提供一种包含序列如SEQIDNO:2所示的mPaDef抗菌肽的克隆载体、表达载体或宿主细胞。更进一步地，所述克隆载体为pUC19，所述表达载体为pPICZαA，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。进一步地，所述毕赤酵母高效制备重组PaDef抗菌肽的方法，具体包括如下步骤：(1)按照SEQIDNO：1所示合成mPaDef基因，合成后的目的基因克隆入pUC19载体上，获得重组质粒pUC-mPaDef，采用表达载体pPICZαA以及EcoRI和KpnI两个限制性酶切位点，构建重组质粒pPICZαA-mPaDef；(2)采用电转法将经过SacI线性化的pPICZαA-mPaDef转入毕赤酵母GS115细胞，构建基因工程重组菌；(3)通过PCR方法筛选转化后长出的单克隆，得到pPICZαA-mPaDef的阳性克隆子；(4)将pPICZαA-mPaDef阳性克隆子进行诱导表达，获得存在于酵母发酵液上清中的重组抗菌肽。更进一步地，诱导表达条件为，当用BMGY培养基培养pPICZαA-mPaDef阳性克隆子的OD值为8.0-10.0时，换成BMMY培养基，并用1.5％的甲醇进行诱导表达。培养基的pH值为6.0，培养温度为28℃。更进一步地，采用ELISA法定量发酵液上清中pPICZαA-mPaDef抗菌肽含量。1.5％甲醇诱导至144h，产量达84mg/L。更进一步地，蛋白纯化时，纯化方法为一步镍柱亲和纯化，分别用低浓度的20、40、60mM咪唑进行梯度漂洗去除杂蛋白，高浓度的500mM进行洗脱，纯度达98％。更进一步地，对重组抗菌肽的最小抑制浓度(MIC)进行测定，对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和大肠杆菌O157(ATCC35150)的MIC为60μg/mL，对单增李斯特菌(ATCC21633)的MIC为50μg/mL，对大肠杆菌(ATCC10305)的MIC为30μg/mL。更进一步地，纯化产物抑菌活性鉴定。结果显示，当受试菌为金黄色葡萄球菌时，浓度为60μg/mL的mPaDef其抑菌活性大小与50μg/mL的庆大霉素(阳性对照)无显著区别；受试菌为单增李斯特菌时，浓度60μg/mL的mPaDef其抑菌活性大小为阳性对照的133％；受试菌为大肠杆菌O157时，浓度100μg/mL的mPaDef其抑菌活性大小为阳性对照的140％；受试菌为大肠埃希氏菌时，浓度100μg/mL的mPaDef其抑菌活性大小为阳性对照的143％。更进一步地，纯化产物稳定性研究。结果显示，mPaDef在不同的温度条件下稳定，能耐受的温度范围为4-90℃；对碱性环境、中性环境以及弱酸性环境较稳定，而对强酸性环境较敏感；对胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K的稳定性也较好。本专利技术的有益效果在于：mPaDef抗菌肽作为一种新型抗菌肽，在毕赤酵母系统中成功高效表达并具有抗菌活性。发现经序列改造后的重组抗菌肽对常见致病菌具有良好的广谱抗菌性，对致病菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157的最小抑菌浓度(MIC)为60μg/mL，对单增李斯特菌的MIC为50μg/mL，对大肠埃希氏菌的MIC为30μg/mL。稳定性研究结果显示，mPaDef对温度、蛋白酶稳定性好，对中性、碱性、弱酸性耐受性好而对强酸性耐受性较差。鉴于此，抗菌肽mPaDef在很多领域如食品、药品、动物生产、植物抗病中显示出巨大的应用潜力。附图说明图1为毕赤酵母高效重组表达mPaDef抗菌肽的技术路线图。图2为mPaDef诱导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组PaDef抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
2016.07.01 CN 20161051165161.一种重组PaDef抗菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。2.一种权利要求1所述重组PaDef抗菌肽的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。3.一种包含权利要求1所述重组PaDef抗菌肽的克隆载体、表达载体或宿主细胞。4.如权利要求3所述的克隆载体、表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述克隆载体为pUC19，所述表达载体为pPICZαA，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。5.如利要求1所述重组PaDef抗菌肽的用途，其特征在于，所述重组PaDef抗菌肽对致病菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157的最小抑菌浓度MIC为60μg/mL，对单增李斯特菌的MIC为50μg/mL，对大肠埃希氏菌的MIC为30μg/mL。6.一种毕赤酵母高效制备权利要求1所述重组PaDef抗菌肽的方法，包括如下步骤：(1)按照S...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊振川，孟德梅，赵静芳，凌霄，代红霞，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12