本发明专利技术提供一种脂肪干细胞的纯化方法，该方法包括：原代脂肪干细胞培养和CD90+细胞群纯化。本发明专利技术还提供纯化后的脂肪干细胞在成骨诱导和成软骨诱导方面的应用。通过本发明专利技术得到的ADSCs中CD90+细胞群，具有更高的干细胞分化潜能，可以提高ADSCs在组织工程中的使用效率和修复效果，在相同诱导条件下，成骨率和成软骨率分别提高了3‑5倍和5‑7倍。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种干细胞的纯化方法，特别涉及一种兔来源脂肪干细胞的纯化方法。
技术介绍
脂肪组织是最富有、最容易获取的间充质干细胞来源。脂肪干细胞(ADSCs)即msc来源于脂肪组织，是一个重要的再生应用的细胞来源。ADSCs从脂肪组织的基质血管部分(SVF)分离得到，它包含多种类型的细胞，如平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。最近的研究显示，ADSCs有能力分化成多种细胞类型(脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞)，刺激血管生成，减少炎症和细胞凋亡。但原代培养未经纯化的ADSCs做为组织工程的种子细胞存在分化能力弱，修复效果不理想等问题。目前大部分都是分离细胞后原代培养直接用，没有进行纯化，造成的缺陷是同样的方法，不同批次培养，由于血管基质成分含量不同，培养出的ADSCs中干细胞含量不同，分化为目的细胞的效率不同，用于组织工程修复效果参差不齐。目前用于纯化的方法主要有微孔过滤膜法（聚氨酯（PU）膜、PLGA/蚕丝膜）、磁珠富集法和流式分选法，用于纯化脂肪细胞的多为微孔过滤膜法，缺陷在于膜的孔径比较难掌握。
技术实现思路
本专利技术首先要解决的技术问题是目的是提供一种脂肪干细胞的纯化方法，该方法采用流式细胞术的方法从原代培养的ADSCs中分选纯化出具有更强干细胞分化潜能的CD90+细胞群，能够做为组织工程的种子细胞，改善组织工程中受损组织的修复效果。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种脂肪干细胞的纯化方法，按如下步骤进行：（1）原代脂肪干细胞培养：取兔源腹股沟处脂肪块置于含100U/ml青霉素-链霉素的PBS中，去掉筋膜和血管，加胶原酶II剪碎，37℃消化2小时，离心，沉淀用含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基重悬，37℃，5%CO2孵箱培养，每3天换液一次，待细胞长至80%时传代，传代1-5次，获得原代脂肪基质细胞的培养液；（2）CD90+细胞群纯化：弃掉步骤（1）原代脂肪基质细胞的培养液，用步骤（1）中的PBS清洗一次后再加入PBS，然后用细胞刮刀将细胞刮下，收集于离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，加入4℃预冷的PBA溶液，1500rpm，3min离心，弃上清，加入鼠抗兔CD90一抗PBA溶液，4℃孵育2小时，1500rpm，3min离心，弃上清，PBS清洗2次，加入抗鼠的FITC标记的荧光二抗的PBA溶液，4℃孵育30min，1500rpm，3min离心，弃上清，PBS清洗2次后用PBS重悬，采用流式细胞仪收集CD90+细胞群，获得纯化后的脂肪干细胞。进一步地，所述PBA溶液为含体积浓度0.5%胎牛血清的PBS。进一步地，所述CD90一抗PBA溶液中CD90一抗与PBA体积比为1:100。进一步地，所述抗兔的FITC标记的荧光二抗PBA溶液中FITC标记的荧光二抗与PBA体积比为1:200。本专利技术还提供一种上述纯化后的脂肪干细胞在成骨诱导和成软骨诱导方面的应用。所述的骨细胞诱导具体是指：细胞长至80%时，0.25%胰酶37℃消化3分钟，血清终止消化后，置于15ml离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，细胞重悬后置于含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基，以细胞浓度5×105细胞/ml种于24孔板中，贴壁后24小时后用骨诱导液进行诱导，每3天换液一次，共诱导2周，用茜素红检测。进一步地，所述骨诱导液购自GIBCO，其成分组成为：dexamethasone10-7M，β-glycerolphosphate10mM，ascorbicacid50ug/ml。所述的软骨细胞诱导具体是指：细胞长至80%时，0.25%胰酶37℃消化3分钟，血清终止消化后，置于15ml离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，细胞重悬后置于含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基，以细胞浓度1x107细胞/ml分装于15ml离心管中，每管1ml，1500rpm，3分钟离心，弃上清，沿管壁缓慢加入含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基，置于37°C，5%CO2培养箱中培养24小时，形成细胞球加入软骨诱导液诱导3周，细胞球经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋成蜡块，切片3um，S.O染色检测软骨细胞生成情况。进一步地，所述的软骨诱导液购自GIBCO，其成分组成为：TGF-β-310ng/ul，dexamethasone10mM，ascorbicacid5mg/ml，sodiumpryruvate100nm。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：通过本专利技术得到的ADSCs中CD90+细胞群，具有更高的干细胞分化潜能，可以提高ADSCs在组织工程中的使用效率和修复效果。本专利技术成功用流式分选法纯化脂肪来源的干细胞，从四方面证实了用流式分选法纯化得到的干细胞特性得以明显提高，（1）形成克隆的能力；（2）干细胞表面标记物的表达量；（3）三系分化的能力；（4）干细胞相关基因表达量上调，脂肪相关基因的表达量下调。通过本专利技术的方法得到的CD90+细胞，细胞增殖率为未纯化细胞的1.5倍，干细胞相关基因表达上调2倍，脂肪相关基因表达下调2-10倍，干细胞表面抗原表达量提高2.5-3.9倍，在相同诱导条件下，成骨率和成软骨率分别提高了3-5倍和5-7倍。附图说明图1为流式分选图片，A、B、C、D、E均为未标记CD90+的空白对照组，F、J、H、I、J为标记CD90+的实验组，J中P4为收集的目的细胞。图2为分选前后细胞培养图片，A为原代脂肪基质细胞，B为CD90+细胞成克隆增殖，C为甲苯胺蓝染色后的细胞克隆。图3为分选前后细胞的三系分化图片，A为原代脂肪基质细胞向脂肪分化图，B为CD90+细胞向脂肪分化图，油红O染色，C为原代脂肪基质细胞向骨分化图；D为CD90+细胞向骨分化图，茜素红染色；E为原代脂肪基质细胞向软骨分化图；F为CD90+细胞向软骨分化图，S.O染色；图3G表示分选后细胞向骨分化中生成的钙盐总量是未分选细胞的7倍，图3H表示向软骨分化中，诱导相同数量的细胞，诱导后形成的细胞球，面积为3-4倍，图3I表示颜色面积4-5倍。图4为分选前后细胞的干细胞表面标记检测图片，A-D为原代脂肪基质细胞的空白对照、CD14、CD105和CD90；E-H是分选后细胞CD90+细胞的空白对照、CD14、CD105和CD90。图5为分选前后细胞的脂肪和干细胞相关基因检测结果图片。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1（1）ADSCs原代细胞培养：取新西兰大白兔一只，雄性，3-4周，静脉注射空气针处死后取腹股沟处脂肪块（带筋膜）置于含100U/ml青霉素-链霉素双抗的PBS（PH7.2-7.4）中，去掉筋膜和血管，加collagenaseII剪碎，37℃消化2小时，离心，沉淀用含体积浓度10%血清的低糖培养基培养（DMEM-L，GIBCO）重悬，37℃，5%CO2孵箱培养。每3天换液一次，待细胞长至80%时传代，P5之前的细胞用于分选，获得原代脂肪基质细胞的培养液。（2）CD90+细胞群分选纯化：弃掉原代脂肪基质细胞的培养液，PBS清洗一次后再加入PBS，然后用细胞刮刀将细胞刮下，收集于15ml离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，加入2ml4℃本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：所述的纯化方法按如下步骤进行：（1）原代脂肪干细胞培养：取兔源腹股沟处脂肪块置于含100U/ml青霉素‑链霉素的PBS中，去掉筋膜和血管，加胶原酶II剪碎，37℃消化2小时，离心，沉淀用含体积浓度10%血清的DMEM‑L培养基重悬，37℃，5%CO2孵箱培养，每3天换液一次，待细胞长至80%时传代，传代1‑5次，获得原代脂肪基质细胞的培养液；（2）CD90+细胞群纯化：弃掉步骤（1）原代脂肪基质细胞的培养液，用步骤（1）中的PBS清洗一次后再加入PBS，然后用细胞刮刀将细胞刮下，收集于离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，加入4℃预冷的PBA溶液，1500rpm，3min离心，弃上清，加入鼠抗兔CD90一抗PBA溶液，4℃孵育2小时，1500rpm，3min离心，弃上清，PBS清洗2次，加入抗鼠的FITC标记的荧光二抗的PBA溶液，4℃孵育30min，1500rpm，3min离心，弃上清，PBS清洗2次后用PBS重悬，采用流式细胞仪收集CD90+细胞群，获得纯化后的脂肪干细胞。
【技术特征摘要】
1.一种脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：所述的纯化方法按如下步骤进行：（1）原代脂肪干细胞培养：取兔源腹股沟处脂肪块置于含100U/ml青霉素-链霉素的PBS中，去掉筋膜和血管，加胶原酶II剪碎，37℃消化2小时，离心，沉淀用含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基重悬，37℃，5%CO2孵箱培养，每3天换液一次，待细胞长至80%时传代，传代1-5次，获得原代脂肪基质细胞的培养液；（2）CD90+细胞群纯化：弃掉步骤（1）原代脂肪基质细胞的培养液，用步骤（1）中的PBS清洗一次后再加入PBS，然后用细胞刮刀将细胞刮下，收集于离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，加入4℃预冷的PBA溶液，1500rpm，3min离心，弃上清，加入鼠抗兔CD90一抗PBA溶液，4℃孵育2小时，1500rpm，3min离心，弃上清，PBS清洗2次，加入抗鼠的FITC标记的荧光二抗的PBA溶液，4℃孵育30min，1500rpm，3min离心，弃上清，PBS清洗2次后用PBS重悬，采用流式细胞仪收集CD90+细胞群，获得纯化后的脂肪干细胞。2.如权利要求1所述的一种脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：所述PBA溶液为含体积浓度0.5%胎牛血清的PBS。3.如权利要求1所述的一种脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：所述鼠抗兔CD90一抗PBA溶液中鼠抗兔CD90一抗与PBA体积比为1:100。4.如权利要求1所述一种脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于：所述抗鼠的FITC标记的荧光二抗PBA溶液中FITC标记的荧光二抗与PBA体积比为1:200。5.权利要求1所得的CD90+细胞在成骨诱导方面的应用，其特征在于：所述的骨细胞诱导具体是指：细胞长至80%时，0.25%胰酶37℃消化3分钟...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋兴辉，沈婷，洪朝阳，李艳伟，王佳佳，王琳琳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。