一种结核分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒，该试剂盒能特异性识别细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF或IL-12p70中至少一个，并能对所识别的细胞因子进行定量分析，还可以特异性识别抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B的特异性IgG抗体。本发明专利技术试剂盒选用的这5种细胞因子是未感染人群与分枝杆菌潜伏感染患者中表达差异最显著的，用于作为分枝杆菌潜伏感染的检测标志物，能够极好地区分潜伏感染者和非感染者，且其表达量高，诊断灵敏度高，再联合检测4种抗原的特异性抗体，进一步加强了诊断的准确性和灵敏性，本发明专利技术试剂盒直接针对血清中的标志物进行检查，操作方便、快速，适于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒
本专利技术属于免疫诊断领域，具体涉及一种结核分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒。
技术介绍
结核病是一个于人类发展史并存的古老疾病，目前仍是一个全球性的卫生问题，全世界估计有三分之一的人口感染过结核分枝杆菌，在这些感染人群中将会有10％的进展为活动性结核。每年新发病例1000万，超过300万人死亡。鉴于对人类生命健康的威胁，世界医学工作者一直没有放松对结核病的研究。结核病的发病流程一般是由健康人群到感染人群，然后经历时间长短不一的潜伏期发展成为活动性结核病。流行病学显示全球人口三分之一是结核分枝杆菌的感染者，如何及时发现、确定结核分枝杆菌的感染人群是实验现结核病一级预防的前提。目前临床现有结核病潜伏感染诊断技术主要是PPD和IFN-γ释放实验。PPD是目前应用最广泛的一种方法，但是其结果判读时间长、结果判读主观性强、敏感性差等缺点。IFN-γ释放实验报告时间两天，检测效能较PPD有所提高，但是其操作繁琐，包括血液采集、细胞分离、细胞刺激培养、免疫学反应、上机检测等多个步骤，且其需要专用的昂贵设备，普及到基层组织不现实。
技术实现思路
针对现有技术所存在的问题，本专利技术通过蛋白芯片技术批量筛选获得能有效区分未感染人群与结核分枝杆菌潜伏感染患者的细胞因子组合，并结合检测血清中的特异性抗体，开发一种准确性高、灵敏性高、操作简便、检测速度快的结核分枝杆菌潜伏感染的血清学免疫诊断试剂盒。本专利技术的目的在于提供一种结核分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是：一种结核分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒，该试剂盒能特异性识别细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF或IL-12p70中至少一个。进一步的，上述试剂盒可对细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF或IL-12p70中至少一个进行定量。进一步的，上述试剂盒能特异性识别细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70，同时能对这5种细胞因子的含量分别进行定量。进一步的，上述试剂盒能特异性识别细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70，同时能对这5种细胞因子的含量分别进行定量，且能特异性识别结核分枝杆菌抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和Ag85B的特异性IgG抗体。进一步的，上述试剂盒的检测原理为ELISA原理。本专利技术的有益效果是：1)本专利技术通过蛋白芯片技术及生物信息学方法进行批量筛选，从中筛选获得5种表达差异最显著的细胞因子(Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p7)作为结核分枝杆菌潜伏感染的检测标志物，能够有效区分未感染人群与结核分枝杆菌潜伏感染患者，且其表达量高，可提高诊断的灵敏度。2)38-KDa、32-KDa、14-16-KDa及AG85B是结核分枝杆菌的特异性菌体抗原，能够在结核分枝杆菌潜伏感染患者体内诱导相应的特异性IgG抗体产生，在检测上述5种细胞因子的同时，再联合检测这4种抗原的特异性抗体，可进一步加强诊断结核分枝杆菌潜伏感染的准确性和灵敏性。3)利用蛋白芯片技术，将上述5种细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p7)的特异性抗体以及38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和AG85B抗原点制成芯片，制成利用ELISA原理检测的试剂盒，从而能够在48小时内检测出不同人群外周血中的细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p7，及抗原38-KDa、32-KDa、14-16-KDa和AG85B的特异性IgG抗体的含量，从而为结核分枝杆菌潜伏感染提供一种更为有效的免疫诊断手段，具备有效的准确性和灵敏性，且操作简便，检测时间快，适于推广应用。4)ELISA原理检测血清当中的标志物，操作简单，不需要昂贵的设备，技术成熟，是普遍使用的检测原理，相对目前临床所应用的IFN-γ释放实验，本专利技术直接针对血清标志物，省去了细胞分离、培养、刺激、孵育等繁琐的步骤，直接针血清中的标志物进行检查，可以方便、快速、稳定地得到检测结果。附图说明图1为结核分枝杆菌潜伏感染者(左)和健康者(右)血清样本的芯片扫描荧光信号图；图2为不同分组中显著差异表达基因的热图(heatmap)区分效果(I：结核分枝杆菌潜伏感染者，N：健康者)；图3为细胞因子组间差异倍数与P值的火山图区分效果；图4为交叉验证错误分类率与阈值的关系(I：结核分枝杆菌潜伏感染者，N：健康者)；图5为5种细胞因子区分两类人群的ROC曲线。具体实施方式本专利技术的研究路线为：1)收集健康组即未感染结核菌人群(Non-infected,N)血清标本12份，结核分枝杆菌潜伏感染患者(I组)人群血清标本21份；2)利用细胞因子抗体芯片，检测在不同人群外周血血清中40种细胞因子的表达量；3)采用Arraytools软件的classcomparison、Classprediction及PAM等方法进行统计分析，筛选得到5种具有显著性差异的细胞因子组合，可有效区分未感染人群与结核分枝杆菌潜伏感染患者；5)选用筛选得到5种具有显著性差异的细胞因子作为结核分枝杆菌潜伏感染的检测标准，并联合检测结核分枝杆菌特异性抗原在患者体内诱导产生的特异性抗体，根据这一机理，制备相应的结核分枝杆菌潜伏感染的免疫诊断试剂盒。下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1一、可用作结核分枝杆菌潜伏感染的血清标志物的筛选(1)样本、材料和方法血清样本信息：如表1所示，12例未感染样本经实验室细胞学检查、临床影像学及病史、查体检查排除结核分枝杆菌感染后纳入健康组(包括：男6例、女6例，年龄在13～43岁之间，平均20.0岁)血清由惠州市结核病防治所提供(见表1中样本分类为“N”的样品)；21例感染者血清取自选自佛山、广州两地(包括：男10例、女11例，年龄在23～59岁之间，平均38岁)，患者均经PPD实验结果结核分枝杆菌特异性抗体检测均为阳性，但临床及实验室检查均排除结核病，(见表1中样本分类为“I”的样品)。表1芯片血清样本信息注：样本分类中，N代表健康人群，I代表结核分枝杆菌潜伏感染人群。样本采集与保存：抽取静脉血4～5ml于2支真空促凝管中，室温静置约30min，4000rpm离心5min，吸取血清均分至2支2ml低温冻存管中，-70℃冰箱保存备用。试剂与仪器：一次性真空促凝管购自广州阳普医疗科技股份有限公司；冻存管、及吸头等一次性耗材均为无酶、无菌进口耗材；由RayBiotech公司提供专业扫描及数据处理；蛋白芯片为美国RayBiotech公司细胞因子抗体芯片，芯片货号：QAH-INF-3，其检测的40种细胞因子类型如表2所示；表2细胞因子抗体芯片(QAH-INF-3)检测的细胞因子类型统计方法：统计分析采用Arraytools软件的classcomparison、Classprediction及PAM等分析方法。(2)芯片筛选血清标志物实验方法：1)将芯片从-80℃冰箱中取出，室温放置(芯片盒开口处包裹吸水纸可减少水汽进入盒内)，芯片盒上无水珠或者雾气后，开盖取出芯片放入1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒能特异性识别细胞因子Eotaxin‑2、MIG、Eotaxin、MCSF或IL‑12p70中至少一个。

【技术特征摘要】
1.能特异性识别细胞因子Eotaxin-2、Eotaxin、MCSF和IL-12p70的试剂盒在制备结核分枝杆菌潜伏感染诊断试剂盒中的应用。2.能对细胞因子Eotaxin-2、Eotaxin、MCSF和IL-12p70进行定量的试剂盒在制备结核分枝杆菌潜伏感染诊断试剂盒中的应用。3.能特异性识别细胞因子Eotaxin-2、MIG、Eotaxin、MCSF和IL-12p70，同时能对这5种细胞因子的含量分别进行定量的试剂盒在制备结核分枝杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈涛，钟球，周琳，陈亮，毕利军，李海成，郭卉欣，周杰，王威，廖庆华，陈瑜晖，蒋莉，尹建军，舒杨，
申请(专利权)人：广东省结核病控制中心，
类型：发明
国别省市：广东;44