本发明专利技术公开了确定器官毒性特别是心脏毒性是否将在选择用各种激酶抑制剂如酪氨酸激酶抑制剂更特别是erbB抑制剂如赫赛汀治疗的患者中发生的方法。此外，还公开了确定潜在药物是否可能产生心脏毒性效应的方法。所述方法涉及分析脂质水平或者脂肪酸氧化酶、pAMP活化的蛋白激酶的表达、葡萄糖摄取，以确定是否存在脂肪酸氧化紊乱。鉴定脂肪酸氧化紊乱可用作为毒性特别是心脏毒性的预测物，和用作为如果施用诸如酪氨酸激酶抑制剂的药物应小心监测器官功能的指示。还公开了保护器官免于代谢性应激和处理细胞如脂肪细胞以减少其脂质含量的方法。
【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2007年2月27日、申请号为200780013697.4的同名申请的分案申请。背景心脏具有强大的ATP生成能力，使其在生物的一生中行使高效泵的功能。成年人的心肌利用脂肪酸(FA)和/或葡萄糖氧化作为其主要能量来源。正常情况下，成年人的心脏通过线粒体中脂肪酸的氧化获得其绝大多数的能量。心肌细胞具有在碳水化合物糖酵解和Krebs循环(三羧酸循环)之间转换并转换至脂肪养料源的能力，从而在不同的生理学和饮食条件下维持ATP以恒定速率生成。该代谢和养料选择的灵活性对于正常的心功能至关重要。尽管心脏能量转化容量和代谢通量在多个层面上受到调节，一 个重要的调节机制发生在基因表达的层面上。参与多重能量转导途径的基因的表达响应于发育、生理学和病理生理学的信号而受到动态调节。参与这些关键能量代谢途径的基因由核受体超家族成员特别是脂肪酸活化的过氧化物酶体增殖因子活化受体(PPAR)和核受体辅激活因子一 PPARy辅激活因子-1 a (PGC-1 α )以及雌激素受体相关蛋白ERRα，、ERR^和ERRy和它们的激活因子PGR-1和PERC在转录水平上进行调节。根据生理学和病理生理学状态心脏PPAR/PGC-1复合物的动态调节将在下面进行更为详尽的说明。PGC-1 α为PPAR Y辅激活因子，与在棕色脂肪中适应性生热有关。两个结构相关的蛋白PGC-1 β和PARC已经得到克隆并且表现出参与调节能量代谢途径。PGC-1 α的组织特异性且诱导型表达提示其参与细胞能量生成代谢过程(包括线粒体的生物发生和氧化、肝糖原异生以及骨骼肌葡萄糖摄取)的动态调节。PGC-1 α在强氧化作用的组织(例如心脏、骨骼肌、棕色脂肪和肝脏)中选择性地表达。心脏中PGC-1a的表达在出生时急剧增加。这与从葡萄糖代谢到脂肪氧化的围产期转换相吻合。还已经知道PGC-1 α的活性和表达水平受冷暴露、禁食以及锻炼(已知促进氧化代谢的刺激)的诱导。培养的心肌细胞中PGC-1的被迫表达诱导参与多重线粒体能量转换/能量产生途径的核与线粒体基因的表达，增加细胞线粒体数量并且刺激偶联的呼吸作用。与这些刺激相关的信号传导途径(包括P38MAP激酶、β -肾上腺素能/cAMP、一氧化氮、AMP激酶和Ca2-钙调蛋白激酶)通过增加PGC-1 α表达或通过其反式激活功能激活PGC-1 α和其下游靶基因。这些代谢和结构的改变可导致扩张性心肌病和心脏的舒张功能障碍。有趣的是，线粒体增殖是可逆的并且心肌病可以通过转基因表达的减少得到补救。这表明除了通过PPAR作用为细胞脂肪酸代谢的激活因子，PGC-1 α与线粒体生物发生相关。因此，PGC-1 α表现出作用为氧化能量代谢的主要调节因子并响应细胞能量状况的变化。新出现证据表明孤儿核受体的雌激素相关受体(ERR)家族作用为心脏和骨骼肌能量代谢的PGC-1-活化调节因子。ERR家族有三个成员:ERRa、ERR0、和ERRy。在主要依赖于线粒体氧化代谢以生成ATP的成年组织(例如心脏和慢收缩骨骼肌)中ERR a和ERR Y的表达升高。出生后在心脏中ERRa的表达急剧增加，伴随参与细胞脂肪酸摄入和线粒体氧化的酶的全面上调。近来已将ERRa和ERR Y确定为辅激活因子PGC-1家族的新配偶体。这种在ERR同种型和PGC-1 a之间功能上的关联激发了对ERR在能量代谢中作用的兴趣。ERRa基因的缺失揭示了 ERRa在脂质代谢的组成型调节中的组织特异性作用。在ERRai小鼠中白色脂肪质量的减少与脂肪细胞大小和脂质合成速率的减少一致。相反地，ERR a很可能在心脏中的脂质分解代谢中起作用，与其和PGC-1 a的功能相互作用相一致。不表现出明显的心脏表型的ERR α-/-小鼠显示出心脏PGC-1 a和ERR Y表达的代偿性增加。这些结果表明ERR同种型促成心脏中脂肪酸代谢基因的组成型表达。然而基因表达改变引起的代谢上的影响尚未为人所知。正使用过量表达ERRa的心肌细胞中的基因表达分析鉴定心脏ERR a靶基因。ERRa激活了参与能量生成途径包括细胞脂肪酸摄取(LPL、⑶36/FAT、H-FABP、FACS-1)、β -氧化(MCAD、VLCAD, LCHAD)以及线粒体电子传递/氧化磷酸化(细胞色素C、C0XIV、C0XVII1、NADH泛醌脱氢酶、黄素蛋白-泛醌氧化还原酶、ATP合酶β)的基因。ERRa也增加心肌细胞中棕榈酸的氧化速率。ERRa对β-氧化酶基因的活化涉及PPAR α信号传导途径。ERRa直接激活PPAR a基因表达，并且在来自于PPAR a +小鼠的细胞中ERR a介导的对MCAD和M-CPT I的调节被消除。目前还已知道ERR a参与PGC-1 a调节线粒体生物发生。已知其通过调节Gapba基因(编码NRF-2复合物的一个亚基并且直接在转录水平上激活参与线粒体氧化代谢的基因)介导PGC-1 α活化NRF途径。ERRa和其辅激活因子PGC-1a激活MCAD、细胞色 素c和ATP合酶β基因启动子。综合起来这些结果将ERR α确定为通过参与PGC-1调节路径对心脏氧化能量代谢的调节因子。然而，在心脏中ERR的精确生物学作用尚未确定。核受体ERR Y (雌激素相关受体Y )在心脏、骨骼肌、肾脏和脑以及发育中的神经系统中高表达。哺乳动物细胞中辅激活因子PGC-1 a和PGC-1 β的表达有力地增强了由ERR Y引起的转录激活。孤儿受体的组成型活化功能2(AF-2)对于协同增强至关重要。功能性受体截短分析已经用于鉴定额外的氨基末端活化功能，这对于ERR Y 2同种型和PGC-1 a是特异性的。体外实验表明ERR Y与这两种辅激活因子均有直接相互作用。这些发现与PGC-1 a和PGC-1 β作为对ERR Y的组织特异性辅激活因子的不同调节功能的假设相吻合。不过需要更多的研究进一步定义这些功能。在转基因小鼠中PGC-1的心脏特异性过表达导致心肌细胞中线粒体失控增殖，致使肌节结构丧失和扩张性心肌病。因此，PGC-1是在对能量需求的响应中控制心脏线粒体数量和功能的重要调节分子。即使不是所有的，大多数这些调节途径涉及信号传导途径中中间体的磷酸化。对磷酸化的抑制，例如通过多种不同的激酶抑制剂的作用，影响这些信号传导途径，导致脂肪酸代谢的改变，其可引起器官毒性，包括心脏毒性。许多新的抗癌药物为激酶抑制剂并且伴有毒性。因此，需要方法以鉴定药物是否伴有毒性作用，以及该毒性作用是否可能在患者体内发生。还需要方法在维持其对抗磷酸化的受体靶的效力同时避免这些抑制剂的毒性作用。概述公开了诊断毒性特别是心脏毒性是否可能在选择用多种药物(例如酪氨酸激酶抑制剂或者erbB抑制剂)进行治疗的患者中发生的方法。此外还公开了评估一种候选药物是否可能具有毒性或者心脏毒性作用的方法。在一种方法中，可分析脂质例如甘油三酯和胆固醇以确定是否存在脂肪酸氧化紊乱。在另一种方法中，可测定负责所观察到的脂肪酸氧化的酶(例如MCAD)。关于脂质水平，认为在正常细胞中AMP活化的蛋白激酶的活化可导致脂质水平的特征性减少，以及糖酵解的和较短碳链中间产物(例如C2至C6碳中间产物)的相应增加。对于本公开内容的目的而言，可将与正常细胞中的特征性脂质减少的任何统计学显著偏差视为脂肪本文档来自技高网...
【技术保护点】
确定药物诱导的细胞毒性的体外方法，所述方法包括：鉴定细胞是否响应使用药物的处理而氧化脂肪酸，其中如果细胞被鉴定为不响应使用所述药物的处理而氧化脂肪酸，那么确定所述药物对细胞是有毒的；或者，其中如果细胞被鉴定为响应使用所述药物的处理而氧化脂肪酸，那么确定所述药物对细胞是无毒的。
【技术特征摘要】
2006.02.27 US 60/777,096;2006.08.02 US 60/821,2301.确定药物诱导的细胞毒性的体外方法，所述方法包括:鉴定细胞是否响应使用药物的处理而氧化脂肪酸，其中如果细胞被鉴定为不响应使用所述药物的处理而氧化脂肪酸，那么确定所述药物对细胞是有毒的；或者，其中如果细胞被鉴定为响应使用所述药物的处理而氧化脂肪酸，那么确定所述药物对细胞是无毒的。2.权利要求1的方法，其中所述毒性是心脏毒性。3.权利要求1的方法，其中所述细胞是心肌细胞。4.权利要求1的方法，其中所述药物是抗癌药物。5.权利要求4的方法，其中所述抗癌药物是酪氨酸激酶抑制剂。6.确定药物诱导的细胞毒性的体外方法，所述方法包括: a)将细胞与药物接触；和 b)分析所述细胞的脂肪酸氧化， 其中如果细胞不响应与所述药物的接触而氧化脂肪酸，那么确定所述药物是有毒的；或者，其中如果细胞响应与所述药物的接触而氧化脂肪酸，那么确定所述药物是无毒的。7.权利要求6的方法，其中所述毒性是心脏毒性。8.权利要求6的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·S·巴克斯，
申请(专利权)人：靶向分子诊断有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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